王軍民，張加研，雷福厚，陳 凱，嚴 毅

1西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室；2西南林業(yè)大學化學工程學院，昆明 650224；3廣西民族大學 廣西林產化學與工程重點實驗室，南寧 530006；4昆明市?？诹謭?，昆明 650114

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，是我國傳統(tǒng)常用中藥材[1]。茯神為茯苓塊中穿有堅實細松根者，長寬4～5 cm，厚4～6 mm，松根直徑不超過1.5 cm，邊緣苓塊可不成方形。茯苓中間生長的松木如為彎曲的松根，似朽木狀，質松體輕，每根直徑不超過2.5 cm[2]?；瘜W合成抗真菌藥物活性較好，但多數(shù)藥物存在毒副作用大、抗菌譜窄、易產生耐藥性等問題[3]，因此尋找一種安全可靠的生物農藥就顯得至關重要。與化學合成抗菌劑相比，用植物資源或其提取物制成的抗菌劑具有安全，環(huán)境友好，對人、動物等非靶標生物無害或毒性較小等優(yōu)點[4]。中藥揮發(fā)油一般具有很好的抗菌活性[5]，同時茯苓在松樹上的生長具有絕對的優(yōu)勢，松樹不易被其它常見真菌感染，故推測松樹被茯苓代謝后的揮發(fā)性成分對其它真菌可能具有拮抗作用?，F(xiàn)代學者對茯神化學成分及生物活性進行了大量的研究[6-8]，但茯神中揮發(fā)性成分的構成和抗菌活性研究未見報道。本研究以茯神為研究對象，優(yōu)化二氧化碳超臨界最佳提取工藝提取茯神揮發(fā)性成分，并對揮發(fā)性成分進行主成分分析，作用于5種常見真菌，研究揮發(fā)性成分對真菌的生物活性，旨在從茯神中探尋得到一種潛在的生物農藥，為開發(fā)和探明茯神新的利用方向奠定基礎。

1 儀器和材料

1.1 實驗材料

茯神采于云南省臨滄市雙江拉祜族佤族布朗族傣族自治縣茯苓種植基地，粉碎后過24目篩備用，茯苓母種為中科院5.78原種。五種真菌分別為腐皮鐮孢Fusariumsolani(CGMCC 3.2889)，禾谷鐮孢Fusariumgraminearum(CGMCC 3.4733)，尖孢鐮孢Fusariumoxysporum(CGMCC 3.3633)，蕓苔鏈格孢Alternariabrassicicola(CGMCC 3.7805)，采絨革蓋菌Coriolusversicolor(CFCC 5336)。

1.2 實驗儀器與試劑

二氧化碳超臨界設備(美國ASI)；Agilent 7890A-5975B型氣質聯(lián)用儀(美國Agilent公司);SQP型萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);高壓滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);超凈工作臺；移液槍、;恒溫培養(yǎng)箱。容量瓶、注射器、0.22 μm無菌濾頭、樣品瓶、1 mL移液槍槍頭、10 mL量筒、250 mL錐形瓶、培養(yǎng)皿、5 mm打孔器、無水乙醚、二甲基亞砜為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 實驗方法

2.1 超臨界提取揮發(fā)油

每次稱取50 g粉碎后樣品進行實驗，實驗采取了單因素控制變量的實驗方式，分別從提取壓力、溫度、二氧化碳的單位時間流量和提取時間4 個方面進行相應的研究實驗。根據實驗結果，因提取時間對提取率的影響關系較小排除時間因素的影響， 在單因素試驗的基礎上，選擇壓力、溫度、二氧化碳的單位時間流量(下文簡稱流量)共3個因素為研究對象，按照3因素3 水平進行Box-Behnken 中心組合設計試驗，因素與水平編碼如表1 所示。

表1 因素與水平編碼

2.2 揮發(fā)油主成分分析

GC條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫：80～240 ℃，程序升溫3 ℃/min；柱流量1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；進樣量0.3 μL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI；質量范圍：35～500；采用NIST14質譜庫檢索計算機定性。

2.3 生物活性研究

精確稱取樣品100 mg，用2%DMSO定容至25 mL，配制為濃度為4 mg/mL的母液，采用梯度稀釋法配制濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL的待測樣液，透過0.22 μm微孔過濾器除菌備用。配制1 L PDA培養(yǎng)基121 ℃滅菌22 min。凝固前轉移至超凈工作臺中分裝至90 mL，冷卻至40 ℃時與10 mL待測樣液混勻，配制得到含揮發(fā)油濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的培養(yǎng)基注入無菌培養(yǎng)皿(9 cm直徑)。每個培養(yǎng)皿中包含10 mL PDA培養(yǎng)基，標記后冷卻凝固備用。溶劑對照采用不加樣品的2% DMSO溶液，空白對照為不加任何樣品和溶液的PDA培養(yǎng)基。

病原真菌的接種與培養(yǎng)：在已活化好的病原真菌菌落上用滅菌后的5 mm打孔器打取菌餅，后轉移至培養(yǎng)皿中心位置，標記后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～10天。所有病原真菌應在同一天內接種完畢。

生長速率計算：培養(yǎng)至第2、4、6、8、10天時，用十字交叉法測量病原真菌的菌落生長直徑，并記錄數(shù)據。抑制率按照如下公式計算[9]。

IR(%)={Do-[Ds-(Do-Dn)]}×100%/Do

IR:抑制率；Do空白對照組菌落直徑；Ds：處理組菌落直徑；Dn：溶劑對照組菌落直徑。

3 實驗結果

3.1 超臨界提取揮發(fā)油

3.1.1 單因素考察

提取壓力考察：固定提取溫度為50 ℃，流量為12 L/min，提取壓力分別為10、15、20、25、30 MPa時，揮發(fā)油提取率分別為0.41、0.53、0.691、1.13、1.14 mg/g。實驗結果表明提取壓力在25 MPa以上時揮發(fā)油的提取率變化趨于平緩，考慮能耗和安全問題初步確定最佳提取壓力為25 MPa。

提取溫度考察：固定提取壓力為25 MPa，流量為12 L/min，提取溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時，揮發(fā)油提取率分別為1.19、1.25、1.5、1.59、1.54 mg/g。實驗結果表明提取溫度在55 ℃時揮發(fā)油的提取率最高，故初步確定最佳提取溫度為55 ℃。

提取流量考察：固定提取壓力為25 MPa，溫度為50 ℃，提取流量分別為6、8、10、12、14 L/min時，揮發(fā)油提取率分別為1.02、0.98、1.25、1.25、1.19 mg/g。實驗結果表明提取流量在10 L/min時趨于平緩，當流量逐漸增大為14 L/min時因分離部分不能及時分離導致部分揮發(fā)油可能隨氣體流失使提取率反而降低。故初步確定最佳提取流量為10 L/min。

3.1.2 響應曲面試驗結果與分析

響應曲面試驗設計、統(tǒng)計及結果分析利用Design-Expert 軟件進行數(shù)據分析，響應面試驗設計結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 中的提取得率數(shù)值以及3個因素進行統(tǒng)計分析，得到了每個因子的顯著性，結果如表3 所示，并得到了揮發(fā)油提取率(Y)對自變量提取壓力(A)、提取溫度(B)、提取流量(C)的多元二次回歸方程為：提取率(Y)=1.61+ 0.13A+ 0.059B+ 0.11C+ 0.01AB+ 0.038AC-0.023BC-0.16A2-0.14B2-0.18C2由表3 的方差分析結果可知，從表3 方差分析結果可知，實驗中選用的模型差異極顯著(P<0.000 1)，表明該2 次方程比較顯著；失擬項0.192 1>0.05，表明失擬不顯著對試驗擬合程度良好，試驗誤差較小，可以用該模型對不同條件下的試驗結果進行預測。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對所得到的回歸模型進行了響應面分析，并對回歸方程的最值求解，得到了模型極值點，即提取壓力、提取溫度、提取流速分別為27.26 MPa、55.97 ℃、10.68 L/min 時，響應值Y 值達到最大，在此工藝下?lián)]發(fā)油提取率預測值為1.66 mg/g，見圖1。受儀器參數(shù)限制，設置取壓力27 MPa、提取溫度56 ℃、提取流速10 L/min時對最優(yōu)工藝進行驗證，提取率實際測定值分別為1.61、1.63、1.63 mg/g，平均值為1.62 mg/g。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果

續(xù)表2

序號No.A 提取壓力Extraction pressure(Mpa)B 提取溫度Extraction temperature(℃)A 流量Flow rate of CO2(L/min)提取率Yield(mg/g)13-1101.22140111.42150001.61160001.62170-1-11.11

表3 Box-Behnken 響應面試驗方差分析

3.2 揮發(fā)油主成分分析

茯神揮發(fā)油樣品中共檢測出21 個物質，全掃描總離子流圖見圖2。通過GC-MS工作站數(shù)據處理系統(tǒng)的NIST14.L 標準譜庫進行相似度檢索，鑒定匹配度大于95的17種可能物質。結果見表4。

由表4可見，從茯神提取物中鑒定出匹配度95以上的17中成分，由歸一法計算含量，鑒定出的成分占總量的84.5%。其中含量最高的為豆甾-3,5-二烯占總含量的42.35%。

3.3 生物活性研究

結果表明茯神揮發(fā)油對尖孢鐮孢菌有一定的抑制作用，揮發(fā)油濃度范圍在0.04～0.08 mg/mL時對:采絨革蓋菌、腐皮鐮孢、禾谷鐮孢菌有一定的促進作用，高濃度時有促進作用變?yōu)橐种谱饔?。對蕓苔鏈格孢菌的作用不太明顯。茯神揮發(fā)油的活性測試結果如表1所示。

4 結論

本實驗首次采用響應曲面法對茯神揮發(fā)油的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對提取率進行預測分析，并通過驗證實驗確定了高提取率的揮發(fā)油提取工藝，為后續(xù)揮發(fā)油的提取和生物活性研究奠定了基礎。

二氧化碳超臨界提取揮發(fā)性成分的過程中發(fā)現(xiàn)提取率隨二氧化碳流量的增加而增加，當流速過大時提取率反而降低，這可能與分離過程中氣體流量過大且冷卻不及時導致?lián)]發(fā)油隨二氧化碳氣體流失而造成損失。

圖1 各因素間的交互作用Fig.1 Interaction among each factor

圖2 GC-MS 全掃描總離子流圖Fig.2 The total ion chromatography in full scan mode of GC-MS

茯神揮發(fā)油的化學成分分析表明，茯神揮發(fā)油中化學成分含有部分的松脂類成分同時也含有其它成分[10，11]，具體區(qū)分應采取不同材料差異提取進行研究，受材料的限制本研究未具體區(qū)分，后期將進行區(qū)分研究。

本實驗在確定最優(yōu)工藝的同時，也首次考察了茯神揮發(fā)性成分對5種真菌的生物活性，在揮發(fā)油作用于腐皮鐮孢菌時低濃度表現(xiàn)出一定的促進作用，高濃度時促進作用消失，生物活性轉變?yōu)橐种谱饔谩Ｒ种谱饔玫漠a生可能與松香酸等松樹原生成分有關，具體機理有待后續(xù)研究。

表4 茯神揮發(fā)油的組成及相對含量

表5 茯神揮發(fā)油提取物對各供試菌的抑菌效果