鄒偉斌 梁秋燕 蔡東伶 陳漢鍶 李仕新 齊冬梅*

（1廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510225）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）普遍存在于健康豬只體內(nèi)，其中具有致病性的菌株可引起豬、人類和其他動物感染豬鏈球菌病[1]。該病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見病，給我國乃至全球生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，影響食品安全及公共衛(wèi)生，給人類的健康甚至生命安全帶來重大威脅，已被我國列為二類動物疾病[2]。本文通過從廣東省某養(yǎng)殖場分離鑒定豬鏈球菌，結(jié)合該菌株的生長特點(diǎn)、生化特征和抗生素敏感性，分析豬鏈球菌的病原學(xué)特性，為豬鏈球菌的培養(yǎng)、疫苗的制備篩選奠定基礎(chǔ)，為完善豬鏈球菌病的防控防治措施提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、革蘭氏細(xì)菌染色試劑盒、豬鏈球菌生化鑒定盒、血瓊脂平板，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；r-Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自英國OXOID公司；PCR引物，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉，購自上海市博微生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

所用菌株均從廣東省某養(yǎng)殖場牛奶樣品中分離得到。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)鑒定

從樣品中分離出來的可疑菌株（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）分別接種在血瓊脂平板（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落的生長形態(tài)，從平板上長出的菌落中挑選具有代表性的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 分離菌株的PCR鑒定

將含有混合菌液的離心管（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）100℃水浴5 min，提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板；然后以16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GG TTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：上、下游引物各2 μL，r-Taq DNA聚合酶25 μL，模板4 μL，滅菌去離子水17 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，然后進(jìn)入35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，對應(yīng)的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 分離菌株的生化鑒定

將分離出的豬鏈球菌新鮮菌苔置于無菌生理鹽水中，配制成菌懸液（約5×108CFU/mL），分別接種于12支微量生化管內(nèi)，35～37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各生化管的顏色變化[3]。

1.2.4 液體培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)

采用單因素法，以10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉作為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（A），通過調(diào)整培養(yǎng)基配方中3種組分的含量，配制營養(yǎng)組分不同的試驗(yàn)組和對照組。將基因測序確定為豬鏈球菌的菌株經(jīng)過純培養(yǎng)得到的二級種子液分別轉(zhuǎn)接到不同營養(yǎng)組分的液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)18 h，用無菌水稀釋至10-6、10-7、10-83個濃度梯度，進(jìn)行平板活菌計數(shù)測定，并對計數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.5 生長曲線測定

將基因測序確定為豬鏈球菌的菌株經(jīng)純培養(yǎng)得到的二級種子液轉(zhuǎn)接到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24 h，從第8個小時起每隔2 h取樣，進(jìn)行平板活菌計數(shù)測定，記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取分離得到的豬鏈球菌純培養(yǎng)物接種到TSA培養(yǎng)基平板上，接種量為每平板菌液100 μL，均勻涂布，用無菌鑷子以“十”字貼法將30種抗生素藥敏片平貼于平板表面，倒置放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測定抑菌圈的大小[4]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)鑒定

3個血瓊脂平板的菌落均呈灰白色，表面光滑，邊緣整齊，周圍無明顯溶血環(huán)，應(yīng)為非溶血性或γ-溶血性鏈球菌；3個菌株的革蘭氏染色均呈紫色，說明均為革蘭氏陽性菌；血瓊脂平板Ⅰ的菌落直徑在0.1～1.0 mm，鏡下可見以長鏈存在的小球菌，血瓊脂平板Ⅱ和Ⅲ的菌落直徑在1～2 mm，鏡下可見菌體成對或中長鏈存在。

2.2 鏈球菌的PCR鑒定

3個菌株的粗提取DNA用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1，均成功擴(kuò)增出目的條帶，約1 500 bp。將對應(yīng)菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定菌株Ⅰ為無乳鏈球菌，菌株Ⅱ?yàn)槿榉挎溓蚓?，菌株Ⅲ為豬鏈球菌。

圖13 株可疑菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 豬鏈球菌的生化鑒定

豬鏈球菌與12支生化鑒定管的反應(yīng)結(jié)果見表1，與山梨醇、七葉苷、甘露醇、乳糖、甘露糖反應(yīng)為陽性，與pH值9.6的肉湯、D-核糖反應(yīng)為弱陽性，與菊糖、松三糖、阿拉伯糖、甘油、棉子糖均不反應(yīng)。

2.4 液體培養(yǎng)基篩選

LB液體培養(yǎng)基單因素篩選設(shè)計見表2，不同液體培養(yǎng)基的活菌計數(shù)結(jié)果見圖2。氯化鈉的主要作用是提供無機(jī)鹽、調(diào)節(jié)滲透壓，由圖2可知，在蛋白胨和酵母提取物含量相同的情況下，氯化鈉含量低于10 g/L時，氯化鈉含量減少，活菌數(shù)減少，而氯化鈉含量高于10 g/L，可抑制菌株的生長；僅改變酵母提取物含量對豬鏈球菌的生長沒有明顯影響；蛋白胨對該菌生長具有明顯的促進(jìn)作用，但達(dá)到一定含量以后，活菌數(shù)量趨于穩(wěn)定。要有效提高豬鏈球菌的活菌數(shù)量，應(yīng)綜合考慮培養(yǎng)基中營養(yǎng)組分的配比，使?fàn)I養(yǎng)成分充分有效利用，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)能最大化。

表1 生化鑒定結(jié)果

表2 LB液體培養(yǎng)基單因素篩選設(shè)計

圖2 不同營養(yǎng)組分的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落活菌計數(shù)結(jié)果

2.5 豬鏈球菌生長曲線測定

從圖3可知，豬鏈球菌活菌數(shù)在16～18 h達(dá)到頂峰，為2.15×108CFU/mL，18 h后活菌數(shù)呈快速下降趨勢，至20 h時活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，20～24 h活菌數(shù)穩(wěn)定在1.60×108CFU/mL左右，34 h時活菌數(shù)又升高至1.80×108CFU/mL。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，可以結(jié)合生長曲線，在合適的時間挑選菌種、菌齡，控制細(xì)菌培養(yǎng)時間，選擇最佳的補(bǔ)料時間，從而減少時間成本投入。

圖3 豬鏈球菌生長曲線測定結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)

豬鏈球菌對30種常規(guī)藥物的藥敏試驗(yàn)測定結(jié)果表明（見表3），試驗(yàn)分離的豬鏈球菌對青霉素、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢曲松等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有極高的敏感度；而對慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素等則表現(xiàn)出一定的耐藥性。在臨床治療過程中，應(yīng)科學(xué)合理地使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，建議交叉用藥或聯(lián)合用藥，從而降低抗生素耐藥的發(fā)生概率。

表3 豬鏈球菌抗菌藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本文分離得到的豬鏈球菌的生化鑒定結(jié)果與甘露醇反應(yīng)呈陽性，臨床上在甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)中，17、19、21這3種血清型中能分離出70%的陽性菌株[5]，可通過多種方法綜合分析，進(jìn)一步鑒定此菌株是否為17、19、21血清型中的一種。本文豬鏈球菌在培養(yǎng)34 h時活菌數(shù)升高，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中隨著部分細(xì)菌死亡，細(xì)菌間養(yǎng)分競爭減少，為細(xì)菌的繁殖提供了條件。蛋白胨作為豬鏈球菌生長所需的重要成分，活菌數(shù)隨蛋白胨含量的增加而增加，但達(dá)到一定含量后，活菌數(shù)變化不明顯，可能是由于氯化鈉和酵母提取物的含量固定，各營養(yǎng)組分的配比不平衡，沒有達(dá)到利用率最大化。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該株豬鏈球菌對青霉素、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢曲松等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有極高的敏感度，在臨床上用于治療和防控豬鏈球菌病具有重大意義，但應(yīng)科學(xué)合理使用此類抗生素，建議交叉用藥或聯(lián)合用藥，從而降低抗生素耐藥的發(fā)生概率。豬鏈球菌的分型繁多，生化特性、生長特點(diǎn)多樣，對其生長特性變化、各分型對藥物的敏感性仍需要開展進(jìn)一步的研究。