徐昌艷 雷丹丹 曹旭林

摘要 [目的]從天冬藥材中提取可用于RAPD擴(kuò)增的高質(zhì)量基因組DNA。[方法]分別采用改良CTAB法、SDS法以及植物基因組DNA提取試劑盒法提取天冬藥材基因組DNA；通過(guò)電泳、DNA濃度與純度檢測(cè)以及RAPD擴(kuò)增效果確定天冬藥材基因組DNA的最佳提取方法。[結(jié)果]CTAB法提取的基因組DNA較完整，DNA濃度與純度均較高，可獲得豐富的、清晰的RAPD條帶。[結(jié)論]CTAB法為天冬藥材基因組DNA提取的最佳方法，提取的DNA可用于天冬RAPD分析，該方法可為其他藥材基因組DNA提取提供參考。

關(guān)鍵詞 天冬；藥材；基因組DNA提取；RAPD

中圖分類號(hào) S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）08-0171-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.045

Abstract [Objective]The research aimed to extract highquality genomic DNA which was used for RAPD amplification from herbal pieces such as ASPARAGI RADIX. [Method]Different methods， CTAB method， SDS method and DNA secure Plant Kit method were used to genomic DNA extract from ASPARAGI RADIX.The DNA samples obtained by the above methods were tested by agarose gel electrophoresis， concentration and purity of DNA and RAPD amplification. [Result]The more profuse and clear RAPD bands were obtained with random primers S7 by using improved CTAB. [Conclusion]CTAB method and RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in ASPARAGI RADIX，which can provide certain reference for the extraction of genomic DNA of Chinese traditional medicine.

Key words ASPARAGI RADIX；Medicinal materials；Extraction of genomic DNA；RAPD

天冬（ASPARAGI RADIX）為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥塊根，主要含有多糖、皂苷等成分[1-3]，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、清肺生津等功效，用于肺燥干咳、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘、熱病津傷等[4]，為烏雞白鳳丸、二冬膏、黨參固本丸、冬白梅片、咽炎片等著名制劑的主要原料藥材。天冬在我國(guó)分布較廣泛，其主產(chǎn)于廣西、貴州、云南等地，并以貴州產(chǎn)的天冬質(zhì)量最好[5]。

近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別而言，具有遺傳穩(wěn)定性、遺傳多樣性、化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，被廣泛用于中藥基源鑒定、道地性研究、植物分類中，而快速、有效地提取高質(zhì)量的基因組DNA成為中藥材分子鑒定的關(guān)鍵。由于大多數(shù)中藥資源分布較為廣泛，其DNA分析標(biāo)記鑒定研究材料多采用新鮮幼嫩葉片，不同分布地域新鮮幼嫩葉片采集較困難。而商品中藥材多為干品，其在加工、貯藏過(guò)程中，如日曬、高溫烘干等會(huì)造成DNA的降解；其次，中藥材不同藥用部位中的多糖、脂質(zhì)、色素、酚類和其他次生代謝產(chǎn)物會(huì)影響基因組DNA的提取[6]。因此，該研究以市售商品藥材天冬為樣品進(jìn)行DNA提取方法研究，以期獲得高質(zhì)量的商品天冬基因組DNA，為中藥材分子標(biāo)記技術(shù)研究提供參考依據(jù)，也為后期基于DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的天冬藥材質(zhì)量與遺傳多樣性的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材 天冬藥材購(gòu)于貴陽(yáng)市花果園藥材市場(chǎng)和貴陽(yáng)市萬(wàn)東橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)覃容貴教授鑒定為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥塊根，標(biāo)本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)中藥材質(zhì)量研究室。

1.2 試劑 DP-320新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京TIANGEN生化科技有限公司）；DNA Marker DL2000；2×Taq PCR MasterMix；GoldView Ⅰ 核酸染色劑；CTAB；SDS；β-巰基乙醇；50×TAE緩沖液；平衡酚；氯仿；異戊醇；醋酸鈉；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DYY-12C電泳儀（北京市六一儀器廠）；L96G型PCR擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)）；電子分析天平（型號(hào)A-L-204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)DK-98-Ⅱ）；XH-B型漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；無(wú)水乙醇等均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 方法

1.3.1 天冬基因組DNA的提取。

1.3.1.1 改良 CTAB 法[7-8]提取天冬藥材DNA。稱取天冬粉末100 mg置于研缽中，加入液氮研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入600 μL 65 ℃預(yù)熱的2%CTAB提取液和2 μL β-巰基乙醇，混勻。再加入6 μL RNA酶，上下顛倒混勻，于65 ℃水浴1 h，期間每20 min顛倒混勻1次。取出冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清液置新的離心管中，加入等體積的酚∶三氯甲烷∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的三氯甲烷∶異戊醇（24∶1），離心10 min，取上清液，再次加入等體積的三氯甲烷∶異戊醇（24∶1），離心10 min。將上清液加入到EP管中，并加入1/3體積的NaAC溶液和1 mL -20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于-20 ℃放置3 h，取出12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用75%乙醇洗滌2次，晾干乙醇，加入50 μL TE溶劑溶解DNA，置于-20 ℃保存，備用。

1.3.1.2 SDS法提取天冬藥材DNA[9-10]。

取天冬藥材粉末2 g，加入10% PVP，并加入適量液氮研磨。將研磨的細(xì)粉轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，加入65 ℃ 預(yù)熱緩沖液2 mL、10% SDS 0.5 mL，混勻，至65 ℃保溫1.5 h，期間每30 min顛倒混勻1次。加入1 mL 5 mol/L KAc，混勻，至冰水中冷卻20 min。以10 000 r/min離心 10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的5 mL離心管內(nèi)，加入3 mL三氯甲烷-異戊醇（V∶V=24∶1） 去除雜質(zhì)，重復(fù)3次。取上清液，加入等體積預(yù)凍異丙醇溶液，冰水冷卻20 min，12 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL 75%乙醇洗滌，10 000 r/min離心10 min，重復(fù)洗滌2次，取沉淀，并室溫放置20 min，加入50 μL TE溶劑溶解DNA，置于-20 ℃保存，備用。

1.3.1.3 植物基因組DNA提取試劑盒法。按照DNAsecure Plant Kit（DP320）說(shuō)明書操作方法，對(duì)天冬干藥材基因組DNA進(jìn)行提取。

1.3.2 天冬藥材基因組DNA的完整性檢測(cè)。

用移液槍吸取8 μL CTAB法、SDS法以及試劑盒法提取的天冬藥材基因組DNA置25 μL EP管中，加入2 μL 6×Loading buffer，混勻，吸取8 μL懸空加入含有GoldView Ⅰ 核酸染色劑的1.0 %瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)，以DNA Marker DL 2000 為參比，放入裝有1×TAE緩沖液的電泳槽內(nèi)，調(diào)電壓至100 V，電泳1 h。取出，置于凝膠成像系統(tǒng)中顯像拍照記錄。根據(jù)點(diǎn)樣孔中有無(wú)殘留，電泳條帶是否清晰，并與DNA Marker 進(jìn)行對(duì)比，判斷提取基因組DNA的完整性。

1.3.3 天冬基因組DNA濃度和純度檢測(cè)。

采用多功能酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)260和280 nm處測(cè)定天冬藥材基因組DNA的OD值即A260/A280的比值，并記錄天冬基因組DNA的純度與濃度。根據(jù)OD260/280的比值是否在1.7～1.9判斷所提取基因組DNA的純度。

1.3.4 天冬藥材基因組DNA的RAPD擴(kuò)增。

為進(jìn)一步驗(yàn)證CTAB法、SDS法以及試劑盒法提取的天冬基因組DNA的質(zhì)量，以RAPD隨機(jī)引物S7（堿基序列：GGTGACGCAG）對(duì)各方法提取的天冬基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增[11-12]。

1.3.4.1 擴(kuò)增程序。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性70 s，55 ℃退火1 min，73 ℃引伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，73 ℃引伸10 min，4 ℃保存1 min。

1.3.4.2 天冬RAPD -PCR體系。RAPD反應(yīng)體系為25 μL，即模板2 μL、引物1 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

1.3.4.3 天冬RAPD-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。

吸取10 μL“1.3.3”項(xiàng)下RAPD-PCR產(chǎn)物，懸空加入1.6%的瓊脂糖凝膠（含有GoldView Ⅰ 核酸染色劑）點(diǎn)樣孔內(nèi)，以DNA Marker DL 2000為參比，以1×TAE為電泳緩沖液在100 V下電泳45 min，取出，置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照、觀察、記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 天冬藥材基因組DNA的完整性檢測(cè)

通過(guò)對(duì)提取的天冬樣品基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖1。1、2泳道無(wú)條帶產(chǎn)生，表明以試劑盒提取法提取天冬藥材DNA的提取效果較差；3和4泳道出現(xiàn)條帶，且條帶清晰，無(wú)拖尾彌散現(xiàn)象，提取效果好，表明以改良CTAB法提取天冬藥材的基因組DNA質(zhì)量較好；5和6泳道也出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，即SDS法亦可用于天冬藥材DNA的提取，但其DNA條帶的亮度較CTAB法暗，表明對(duì)天冬藥材DNA的提取效果CTAB法優(yōu)于SDS法。因此，初步認(rèn)為天冬藥材基因組DNA提取宜采用CTAB法。

2.2 天冬藥材基因組DNA濃度和純度檢測(cè)

通過(guò)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)天冬基因組DNA的純度，見(jiàn)表1。根據(jù)OD260/280比值判斷基因組DNA的純度，當(dāng)OD260/280值在1.70～1.90時(shí)，表明提取的DNA純度較高，質(zhì)量較好；當(dāng)OD260/280值低于1.70 時(shí)，表明提取的DNA中有多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染；若OD260/280值大于1.90時(shí)，表明提取的DNA有一定程度的降解或受RNA污染。根據(jù)表1比較3種方法提取的天冬DNA的濃度與OD260/280值可知，以CTAB法提取的DNA純度較高，質(zhì)量好。

2.3 天冬藥材基因組DNA的RAPD擴(kuò)增

以RAPD隨機(jī)引物對(duì)不同方法提取的天冬樣品DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增效果進(jìn)行比較。從圖2可以看出，以CTAB法提取的2個(gè)天冬樣品DNA擴(kuò)增條帶豐富、清晰、明亮、多態(tài)性高；SDS法提取的其中一個(gè)樣品擴(kuò)增條帶較少，且有模糊的二聚體存在；以試劑盒提取法的擴(kuò)增效果最差，僅得到一些相對(duì)分子質(zhì)量小的條帶。綜上檢測(cè)結(jié)果，將CTAB法確定為天冬藥材基因組DNA提取的最佳方法。

3 討論與結(jié)論

中藥材藥用部位大多是老化的組織，其中含有大量的多酚和多糖類物質(zhì)，尤其是天冬藥材中多糖含量很高，這對(duì)提取其基因組DNA造成嚴(yán)重干擾。由于植物細(xì)胞在死亡過(guò)程中，也會(huì)產(chǎn)生某些次生物質(zhì)與DNA形成復(fù)合物降低DNA的溶解度或使其產(chǎn)生不同程度的褐變。而對(duì)于市售藥材多經(jīng)過(guò)加工或簡(jiǎn)單粗加工，因此藥材中DNA可能受日曬、烘干等加工方式的影響產(chǎn)生不同程度的降解。這些因素均使提取藥材中的DNA變得困難。故尋找一種方便、快速且適合藥材基因組DNA提取的方法顯得尤為重要[6]。