張莎莎 吳振聰 楊轉(zhuǎn)

摘要[目的]研究鮑內(nèi)臟活性物質(zhì)對(duì)小鼠腸道微生物的影響。[方法]從鮑內(nèi)臟中制備多肽并灌胃小鼠，利用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)分析小鼠腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化。[結(jié)果]門水平上，小鼠腸道微生物最優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），占總序列的69.10%；其次為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），分別占總序列的23.50%和5.00%，變形菌門又以δ-變形菌綱居多。屬水平上，最優(yōu)勢(shì)類群為擬桿菌目（Bacteroidales）的一個(gè)未知分類屬，占30.33%；其次為擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides），分別占12.47%和9.80%。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，小鼠腸道中豐度前30位的菌屬中有4個(gè)屬的豐度上調(diào)，其中副擬桿菌屬（Parabacteroides）的豐度顯著上調(diào)。豐度下調(diào)的屬有7個(gè)，其中毛螺菌科（Lachnospiraceae）一個(gè)未分類屬和厭氧支原體屬（Anaeroplasma）豐度顯著下調(diào)。[結(jié)論]灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物多樣性呈增加的趨勢(shì)，且在小鼠腸道中檢測(cè)到一些與宿主健康相關(guān)的差異細(xì)菌類群。

關(guān)鍵詞鮑內(nèi)臟多肽；腸道微生物；Illumina Miseq測(cè)序

中圖分類號(hào)S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）08-0093-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.024

Abstract[Objective] To study the effects of visceral active substance of abalone on intestinal microbe of mice by Illumina Miseq sequencing. [Method] Polypeptide extracted from abalone viscera and mice was fed with it by intragastric administration. The community structure and dynamic changes of intestinal microbe of mice were analyzed by using Illumina Miseq sequencing. [Result] The most dominant phyla of bacteria in the intestine of mice were Bacteroides， accounting for 69.10% of the total sequence， followed by Firmicutes and Proteobacteria（ accounting for 23.50% and 5.00% of the total sequences， respectively）. Proteobacteria was dominated by δProteobacteria.At the genus level， the most dominant group was norank_f_Bacteroidales_S247_group， accounting for 30.33%， followed by Alloprevotella and Bacteroides（accounting for 12.47% and 9.80%， respectively）. After the intragastric administration of abalone polypeptide， the abundance of 4 bacterial genera in the intestine of mice increased， among which the genus Parabcteroides significantly increased （P<0.05）. The abundance of 7 genera decreased， amongwhich the genus norank_f_Lachnospiraceae and Anaeroplasma significantly decreased （P<0.05）. [Conclusion] The intestinal microbial diversity of mice after intragastric administration of abalone viscera polypeptide， and some differentiated bacterial groups related to host health were detected in the intestinal tract of mice.

Key wordsAbalone viscera polypeptide；Intestinal microbiota；Illumina Miseq sequencing

鮑是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋貝類，但居我國傳統(tǒng)四大海味之首，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味濃鮮美，深受大眾喜愛。鮑具有滋陰補(bǔ)虛、養(yǎng)肝明目等功效[1]。鮑內(nèi)臟是指除去鮑外殼和肉質(zhì)后剩余的肝臟、消化系統(tǒng)等部分，約占整個(gè)鮑重量的25.0%，其營(yíng)養(yǎng)成分及組成與鮑肌肉中的類似，都含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪以及多種生物活性物質(zhì)，比如盤鮑內(nèi)臟中含有包括人體必需的7種氨基酸在內(nèi)的16種氨基酸[2]。鮑內(nèi)臟中含有3.72%的粗脂肪，要比肌肉中的含量多3倍，而鮑脂肪中有含量較高的二十碳五烯酸，具有改善心血管循環(huán)的作用。鮑內(nèi)臟中還含有豐富的酶類、DHA、EPA、?；撬岬壬砘钚晕镔|(zhì)以及一些維持神經(jīng)肌肉興奮的微量元素。在鮑的食用和加工過程中，鮑內(nèi)臟往往被直接遺棄，不僅浪費(fèi)資源，而且會(huì)造成環(huán)境污染[3-4]。

隨著人們對(duì)海洋生物活性物質(zhì)的逐步認(rèn)識(shí)以及人們對(duì)環(huán)境污染的關(guān)注，海產(chǎn)品加工中的廢棄物逐漸得到利用和開發(fā)。比如，魚內(nèi)臟蛋白水解物對(duì)人體健康的生物作用[5]；從文蛤中分離到的多肽對(duì)人肺癌細(xì)胞具有抑制作用[6]；從草魚蛋白中分離到的新型多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7]。對(duì)鮑內(nèi)臟活性物質(zhì)的研究也有一些報(bào)道，如酶解鮑內(nèi)臟所得產(chǎn)物具有體外抗氧化活性[8-9]；鮑內(nèi)臟蛋白肽具有一定的體外自由基清除能力和較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性，并能增強(qiáng)小鼠的免疫功能[10]；鮑內(nèi)臟水解液能降低肝素輔因子HCⅡ介導(dǎo)的凝血酶抑制率，改善血液的抗凝作用，大大延緩了凝血時(shí)間[11]。

腸道微生物是生物體的重要組成部分，是宿主“被遺忘的器官”[12]，影響著宿主的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理和病理[13-14]。目前對(duì)海洋生物多肽生物活性的評(píng)估大多集中在體內(nèi)外抗氧化、抗腫瘤活性和免疫指標(biāo)測(cè)定等方面[4，15]，對(duì)宿主腸道微生物影響方面的研究尚未見報(bào)道。筆者以模式動(dòng)物小鼠為研究對(duì)象，利用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)研究灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，從腸道微生物的角度研究鮑魚內(nèi)臟活性物質(zhì)對(duì)宿主的影響，進(jìn)一步完善海洋多肽的生物活性評(píng)估，并為研制改善腸道微生物的益生元奠定基礎(chǔ)。此外，該研究在提升鮑內(nèi)臟的附加值，促進(jìn)廢物利用，減少環(huán)境污染等方面也具有重要意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體重190～230 g。

1.2試材與試劑

堿性蛋白酶（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）；糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；GoodView熒光染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；酶、生化試劑等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀 S1000，為BIO-RAD公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)，為北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；CAVOY電泳儀PP-1153、電泳槽均為北京凱元信瑞儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，為上海培清科技有限公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1鮑內(nèi)臟多肽的制備。皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）內(nèi)臟來自廈門島之源生物科技有限公司，制備方法參考何傳波等[11]的方法。皺紋盤鮑的內(nèi)臟經(jīng)凍干磨粉處理，用堿性蛋白酶水解后滅酶，冷卻離心，上清過濾得透過液為多肽（以小分子肽為主），所得多肽凍干備用。

1.4.2樣品采集。將SPF級(jí)雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前，隨機(jī)選取12只小鼠采集糞便樣品，每4只小鼠的糞便合并為1個(gè)樣品，共3個(gè)樣品（編號(hào)為K01、K02和K03）。然后將小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（K）和灌胃鮑內(nèi)臟多肽的處理組（PH），每組12只小鼠。K組灌胃生理鹽水1 200 mg/（kg·d），PH組灌胃鮑內(nèi)臟多肽1 200 mg/（kg·d）。試驗(yàn)期為28 d，分別在試驗(yàn)的第14、28天采集小鼠糞便，每4只小鼠的糞便混合為一個(gè)樣品，每組3個(gè)平行樣品。第14天的6個(gè)樣品為K141、K142、K143、PH141、PH142、PH143，第28天6個(gè)樣品為K281、K282、K283、PH281、PH282、PH283。

1.4.3

DNA提取及Illumina Miseq高通量測(cè)序。小鼠糞便基因組DNA提取按照天根糞便基因組DNA試劑盒的步驟進(jìn)行，提取后送至美吉生物公司進(jìn)行Illumina Miseq PE300測(cè)序。通過美吉公司云平臺(tái)i-sanger，將所得序列先根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化。然后，再對(duì)優(yōu)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類學(xué)分析，在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。通過單樣本分析小鼠糞便樣品中的微生物菌群豐度和多樣性（α-多樣性）。為研究不同樣本間的相似性和差異關(guān)系，根據(jù)Bray-Curtis距離矩陣對(duì)樣本進(jìn)行PCoA分析（principal coordinates analysis），即主坐標(biāo)分析，可視化呈現(xiàn)小鼠糞便樣本中微生物群落的差異程度。最后，通過Heatmap圖對(duì)小鼠糞便樣品進(jìn)行分析，根據(jù)高豐度和低豐度的物種分塊聚集可知，不同分組的樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

2結(jié)果與分析

2.1α-多樣性指數(shù)分析

15個(gè)樣品共獲得754 345個(gè)reads，測(cè)得樣品的覆蓋率在99%以上，各樣品獲得的reads為40 828～59 970個(gè)，平均每個(gè)樣品的reads為（50 290±1 379）個(gè)。由于各樣品測(cè)序深度不同可能會(huì)帶來多樣性分析誤差，因此將樣品均一化到40 000條序列后再進(jìn)行后續(xù)分析。

chao1指數(shù)用來估計(jì)物種總數(shù)，F(xiàn)aiths PD指數(shù)反映某一樣品物種組成的系統(tǒng)進(jìn)化特征多樣性；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來估算樣品中微生物多樣性，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。從表1可以看出，灌胃鮑內(nèi)臟多肽的處理組（PH）的Chao1指數(shù)和Faiths PD指數(shù)均比同期對(duì)照組（K）要高，灌胃鮑內(nèi)臟多肽能增加小鼠腸道微生物多樣性的趨勢(shì)，但各組間差異均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。試驗(yàn)第28天處理組（PH）的Simpson指數(shù)顯著低于同期對(duì)照組（K）（P<0.05），但對(duì)照組和處理組間Shannon指數(shù)差異不明顯。

2.2PCoA分析

小鼠腸道微生物在門、屬、OUT水平上的PCoA分析結(jié)果見圖1。在各水平上，與對(duì)照組相比，鮑內(nèi)臟多肽處理組的樣品PH141、PH142、PH143、PH281、PH282和PH283均相對(duì)集中地聚在一起，而對(duì)照組較為分散。這說明小鼠在灌胃鮑內(nèi)臟多肽后其腸道微生物發(fā)生了一定的偏移，灌胃鮑內(nèi)臟多肽對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)造成了一定的影響。第14、28天采集的鮑內(nèi)臟多肽處理組樣品未分開，在該試驗(yàn)條件下延長(zhǎng)灌胃時(shí)間對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響不明顯。

2.3小鼠腸道微生物門水平上的菌群構(gòu)成及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對(duì)其影響

小鼠腸道中檢測(cè)到的微生物序列可分為13門，分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、Saccharibacteria門、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrcomicrobia）、TM6_Dependentiae門、放線菌門（Actinobacteria）、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中優(yōu)勢(shì)類群為擬桿菌門，占總序列的69.10%，其次為厚壁菌門和變形菌門，分別占總序列的23.50%和5.00%，其中變形菌門又以δ-變形菌綱居多，占所有序列的3.80%，此外還有少量的α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和ε-變形菌綱細(xì)菌，所占比例均不到1%。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、Saccharibacteria門和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）在所有樣品中也均能檢測(cè)到，但所占比例均不到1%。放線菌門（Actinobacteria）在各個(gè)樣品中都有檢出，但豐度很低，不到0.1%。綠彎菌門（Chloroflexi）、綠菌門（Chlorobi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、TM6_Dependentiae等僅在PH141樣品中檢測(cè)到。不同采樣時(shí)間的對(duì)照樣品相比，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，軟壁菌門的豐度有所下降，而放線菌門的豐度有所上升。與同期對(duì)照組相比，灌胃鮑內(nèi)臟多肽后脫鐵桿菌門、Saccharibacteria門和軟壁菌門豐度下調(diào)，其中軟壁菌門豐度顯著下調(diào)，而放線菌門和擬桿菌門豐度上調(diào)（圖2）。

2.4小鼠腸道微生物屬水平上的構(gòu)成及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對(duì)其影響

小鼠糞便樣品中共檢測(cè)到110屬，選取豐度前30位的屬繪制成熱圖，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，小鼠腸道中平均豐度較高的屬有擬桿菌目（Bacteroidales）的一個(gè)未分類的屬、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、另枝菌屬（Alistipes）、毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、螺桿菌屬（Helicobacter）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）未分類屬、瘤胃菌科UCG-04（Ruminococcaceae_UCG-014）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、梭菌目vadinBB60組（norank_f__Clostridiales_vadinBB60_group）等。其中擬桿菌目的未分類屬占比30.33%，為優(yōu)勢(shì)菌屬；其次是擬普雷沃菌屬，占比12.47%；擬桿菌屬占比9.80%，另枝菌屬占比7.87%。

灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，與對(duì)照組相比，豐度上調(diào)的屬有4個(gè)：理研菌科RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、普雷沃氏菌科NK3B31（Prevortellaceae_NK3B31_group）、普雷沃氏菌科UCG-001；其中，副擬桿菌屬的豐度上調(diào)與對(duì)照間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。灌胃鮑多肽后豐度下調(diào)的屬有7個(gè)，分別為螺桿菌屬、毛螺菌科未分類屬、顫螺旋菌屬（Oscillibacter）、Anaerotruncus屬、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和厭氧支原體屬（Anaeroplasma）。其中，厭氧支原體屬與對(duì)照間的豐度差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

3結(jié)論與討論

筆者采用Illumina高通量測(cè)序?qū)π∈竽c道微生物的群落結(jié)構(gòu)及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對(duì)其的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，雖然反映腸道微生物多樣性的Shannon指數(shù)、Faiths PD指數(shù)與對(duì)照間差異未達(dá)到顯著水平（P>0.05），但鮑內(nèi)臟多肽處理組均高于對(duì)照組，第28天Simpson指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物多樣性有增加的趨勢(shì)。后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)延長(zhǎng)試驗(yàn)周期，進(jìn)一步考察灌胃鮑內(nèi)臟多肽對(duì)小鼠腸道微生物多樣性的影響。

該研究中PCoA分析結(jié)果表明，灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物在門、屬和OTU水平上有趨同聚類趨勢(shì)，但整體上還是比較分散，對(duì)照組樣品更為分散。這可能是由于小鼠間個(gè)體差異造成的。比如在PH141中檢測(cè)到綠彎菌門、綠菌門、浮霉菌門、TM6_Dependentiae等，但在其他樣品中極少或未檢測(cè)到。盡管該試驗(yàn)采集的每個(gè)樣品都是4只小鼠糞便的混合物，但重復(fù)數(shù)偏少（3個(gè)重復(fù)），后續(xù)研究應(yīng)增加生物學(xué)重復(fù)，以減少個(gè)體差異帶來的影響。

該研究中灌胃鮑內(nèi)臟多肽后在小鼠腸道中檢測(cè)到一些與宿主健康相關(guān)的差異細(xì)菌類群。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，豐度顯著上調(diào)的副擬桿菌Parabacteroide能有效產(chǎn)生和分泌水解酶，是厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中的優(yōu)勢(shì)種群[16]。豐度上調(diào)的理研菌科_RC9_gut組也被發(fā)現(xiàn)在酒精液體飼料誘導(dǎo)的酒精性肝病中顯著下降[17]，暗示了該菌與小鼠健康之間的關(guān)聯(lián)性。普雷沃氏菌科NK3B31組和普雷沃氏菌科UCG-001也是上調(diào)類群，這些菌屬可以幫助分解蛋白質(zhì)和碳水化合物食物，且與退行性疾病有關(guān)[18-19]。

該研究中灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道毛螺菌科一未分類屬、厭氧支原體屬的豐度顯著下調(diào)。毛螺菌科在腸道中較早被發(fā)現(xiàn)，含量豐富，該科的菌種之間差異很大。已有研究表明，與健康的個(gè)體相比，毛螺菌科在非酒精性脂肪性肝病的小鼠[20]及患過敏性紫癲幼兒的腸道內(nèi)有更高的豐度[21]，但具體功能有待進(jìn)一步研究。厭氧支原體是一類無細(xì)胞壁的細(xì)菌，關(guān)于其功能的研究報(bào)道很少，其具體生理功能尚有待進(jìn)一步研究。其他一些豐度下調(diào)（未達(dá)到顯著水平）的屬中，螺桿菌屬中最廣為人知的幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）是感染率較高的致病菌。顫螺旋菌屬（Oscillibacter）、Anaerotruncus屬等在抵抗肥胖方面起作用[22]，這可能與鮑內(nèi)臟多肽是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)有關(guān)。

由于方法和數(shù)據(jù)庫信息的限制，該研究獲得的一些差異和未知的細(xì)菌類群尚需要進(jìn)一步鑒定，并對(duì)差異細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)合其生理功能進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步闡明鮑內(nèi)臟多肽對(duì)腸道微生物及宿主的影響，為海洋生物活性物質(zhì)的功效評(píng)價(jià)提供新思路。

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