袁銳 劉訓(xùn)猛 陳靜

摘要[目的]了解江蘇省鯽魚造血器官壞死病的流行情況。[方法]應(yīng)用PCR方法對2015—2017年的養(yǎng)殖鯽魚成魚和苗種進(jìn)行病原鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）檢測，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。[結(jié)果]共檢測樣品265例，檢出陽性樣品32例，陽性率為12.83%，其中陽性率最高的年份陽性率高達(dá)25.00%。安徽省主要養(yǎng)殖鯽魚區(qū)域均具有較高感染風(fēng)險(xiǎn)，無論成魚還是苗種均可感染CyHV-2，而病原的遺傳同源性高度統(tǒng)一，提示江蘇地區(qū)CyHV-2未發(fā)生明顯變異。[結(jié)論]該研究可為江蘇地區(qū)鯽魚造血器官壞死病風(fēng)險(xiǎn)分析提供基本數(shù)據(jù)，并為該病的防控措施提供參考。

關(guān)鍵詞江蘇?。祸a魚造血器官壞死??；鯉皰疹病毒2型；遺傳同源性；風(fēng)險(xiǎn)分析

中圖分類號S941文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0104-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.027

Abstract[Objective] To investigate the prevalence of haematopoietic necrosis of Carassius auratus in Jiangsu Province.[Method]PCR method was used to detect CyHV2 in adult and seedlings of cultured Carassius auratus from 2015 to 2017.And the risk assessment was made. [Result]265 samples were detected，among which 32 positive samples of CyHV2 were detected.CyHV2 positive rate was 12.83%，and the the positive rate was 25.00% in the year with the highest positive rate.C.auratus from main breeding areas of Jiangsu Province had greater risk of infection，both adults and seedlings could be infected with CyHV2.The genetic homology of the pathogen was highly uniform， suggesting that there was no significant variation of CyHV2 in Jiangsu Province.[Conclusion]The research could provide basic data for risk analysis of hematopoietic necrosis of C.auratus in Jiangsu Province， and provide references for the prevention and control measures of this disease.

Key wordsJiangsu Province；Haematopoietic necrosis of Carassius auratus；CyHV2；Genetic homology；Risk analysis

鯽魚造血器官壞死病是一種由鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）引起的急性、出血性并伴有高度傳染的流行病，致死率極高[1-2]，近年來在我國內(nèi)地鯽魚主養(yǎng)區(qū)大規(guī)模暴發(fā)流行，尤其是江蘇地區(qū)，發(fā)病區(qū)域的死亡率在50%以上，嚴(yán)重地區(qū)達(dá)90%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病的主要臨床癥狀為鰓出血并伴有體表和鰭基部出血[3]，發(fā)病急、死亡率高，常于春末或初秋兩季暴發(fā)，造成養(yǎng)殖鯽魚的大量死亡，目前已蔓延至全球多個(gè)國家和地區(qū)，遍布亞洲、北美洲、歐洲、大洋洲等[1，3-7]。

CyHV-2自2012年在我國江蘇北部鯽魚主養(yǎng)區(qū)被發(fā)現(xiàn)后一直呈現(xiàn)蔓延趨勢，目前江蘇、北京、武漢、廣州等地區(qū)養(yǎng)殖異育銀鯽體內(nèi)均已檢出該病毒[8-9]。除養(yǎng)殖鯽魚外，我國野生鯽魚調(diào)查結(jié)果顯示湖北洪湖、安徽巢湖等地的野生鯽魚也不同程度攜帶鯉皰疹病毒2型[10]，說明該病毒在我國已經(jīng)廣泛存在。目前，尚缺乏有效控制該病毒的藥物和方法，疫苗的研制被認(rèn)為是防控該病的最有效方法之一。江蘇地區(qū)作為我國鯽魚的重要養(yǎng)殖區(qū)域，對該病進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，掌握其流行規(guī)律，并對存在的主要風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)進(jìn)行分析，對于疾病的防控具有重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器。

病毒DNA提取試劑盒，為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；DL 2000 DNA Marker，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Premix TaqTM ，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DEPC水，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；高速冷凍離心機(jī) 5417R，為Eppendor 公司產(chǎn)品；普通PCR儀，為Bio-Rad 公司產(chǎn)品；凝膠成像儀與電泳儀均為 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.1.2引物。參照文獻(xiàn)[11]中引物序列，分別合成針對鯉皰疹病毒2型聚合酶基因的1對特異性引物：Polymerase-F引物序列為5′-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3′；Polymerase-R引物序列為5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′，擴(kuò)增長度均為362 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品合成。

1.2方法

1.2.1樣品采集與處理。

2015—2017年，在江蘇各地鯽魚養(yǎng)殖區(qū)域共采集265份鯽魚樣品，取樣品的鰓、腎臟、肝臟、脾臟組織保存于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室。若不能立即進(jìn)行鯉皰疹病毒2型檢測，則需要轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2DNA提取。

參照生工生物工程（上海）股份有限公司的病毒核酸提取試劑盒說明書，提取病毒基因組DNA。取魚鰓組織或肝臟、脾臟、腎臟等組織100 mg，放入1.5 mL離心管中，用一次性研磨棒充分研磨后加入300 μL 裂解液和20 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻，56 ℃溫浴2 h，直到組織消化完全（如果未消化完全，需要再加入蛋白酶K繼續(xù)消化）；加入200 μL BD緩沖液，混勻，70 ℃溫浴10 min；加入300 μL無水乙醇，搖動充分混勻；將以上混合的樣品液加入小柱的小管中，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心3 min后，去離心液；加入500 μL PW溶液，10 000 r/min離心1 min，去離心液；加入500 μL洗脫液，10 000 r/min離心1 min，去離心液；10 000 r/min離心2 min，盡量消除殘余乙醇；將小柱加入新的1.5 mL離心管中，加入30 μL 洗脫緩沖液到小柱中央，60 ℃溫浴5 min，10 000 r/min離心1 min后得到的液體即包含病毒核酸，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴(kuò)增與檢測。

以提取的病毒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：Premix TaqTM 25 μL，上、下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L），DNA模板為2.5 μL，加ddH2O 20.5 μL；PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像掃描儀進(jìn)行記錄。

將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠回收后，與pMD18-T載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，涂布含Amp的LB平板，挑去白色菌落，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4陽性序列同源性比較。使用MEGA7軟件進(jìn)行陽性序列同源性比較和分析。

1.2.5風(fēng)險(xiǎn)評估。根據(jù)2015—2017年監(jiān)測結(jié)果以及流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，分析鯽魚不同養(yǎng)殖階段、不同養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖區(qū)域的鯽魚造血器官壞死病流行風(fēng)險(xiǎn)；根據(jù)陽性病原的同源性分析結(jié)果，分析毒株的變異風(fēng)險(xiǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1監(jiān)測結(jié)果

2.1.12015年監(jiān)測結(jié)果。

2015年在江蘇省內(nèi)共采集鯽魚樣品70個(gè)，樣品主要分布如下：鹽城市24個(gè)、揚(yáng)州市11個(gè)、淮安市10個(gè)、泰州市8個(gè)、南京市5個(gè)、常州市4個(gè)、鎮(zhèn)江市4個(gè)、徐州市4個(gè)。陽性樣品檢出的電泳結(jié)果如圖1所示，共檢出CyHV-2陽性樣品9個(gè)，陽性率為12.86%，其中江寧陽性樣品2個(gè)，寶應(yīng)、句容、東臺、高港、興化、高郵、大豐各1個(gè)。這表明陽性樣品主要分布在鹽城、揚(yáng)州、泰州、南京、鎮(zhèn)江等江蘇省鯽魚的主要養(yǎng)殖區(qū)域。

2.1.22016年監(jiān)測結(jié)果。

2016年在江蘇省內(nèi)共采集鯽魚樣品72個(gè)，樣品主要分布如下：鹽城市24個(gè)、揚(yáng)州市14個(gè)、徐州市12個(gè)、淮安市10個(gè)、泰州市8個(gè)、無錫市3個(gè)、南京市1個(gè)。陽性樣品檢出的電泳結(jié)果如圖2所示，共檢出CyHV-2陽性樣品18個(gè)，陽性率達(dá)25.00%，其中大豐7個(gè)，東臺4個(gè)、射陽4個(gè)、徐州云龍區(qū)1個(gè)、銅山1個(gè)、興化1個(gè)。這表明陽性樣品主要集中在鹽城這一鯽魚養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量最大的地區(qū)，而徐州、泰州也檢出少量陽性樣品。

2.1.32017年監(jiān)測結(jié)果。2017年在江蘇省內(nèi)共采集鯽魚樣品179個(gè) ，樣品主要分布如下：鹽城市64個(gè)、淮安市31個(gè)、揚(yáng)州市30個(gè)、常州市10個(gè)、徐州市8個(gè)、泰州市8個(gè)、無錫市7個(gè)，南通市6個(gè)、連云港6個(gè)、泰州市6個(gè)、宿遷市4個(gè)、南京市3個(gè)。陽性樣品檢出的電泳結(jié)果如圖3所示，共檢出CyHV-2陽性樣品7個(gè)，陽性率為3.91%，其中大豐2個(gè)，東臺2個(gè)、射陽2個(gè)、江寧1個(gè)。結(jié)果顯示，鹽城地區(qū)共檢出6個(gè)陽性樣品，南京也檢出1個(gè)陽性樣品。

2.1.4總體流行情況分析。

對江蘇省內(nèi)養(yǎng)殖鯽魚CyHV-2進(jìn)行了連續(xù)3年的跟蹤監(jiān)測，共檢測樣品265個(gè)，檢出陽性樣品34個(gè)，陽性率為12.83%。其中，2015年CyHV-2陽性率為12.86%，2016年陽性率達(dá)25.00%，2017年陽性率為3.91%（圖4）。2015—2016年，養(yǎng)殖成魚的CyHV-2陽性率呈明顯升高的趨勢，可見CyHV-2對鯽魚成魚健康養(yǎng)殖的危害極大。為了探尋CyHV-2在鯽魚苗種中的攜帶情況，2017年以苗種場的監(jiān)測為主，涵蓋了包括國家級良種場和省級良種場在內(nèi)的各類重點(diǎn)苗種場，從監(jiān)測結(jié)果來看，苗種的CyHV-2陽性率明顯低于成魚。這說明相對于苗種生產(chǎn)，鯽魚養(yǎng)殖過程中感染CyHV-2的風(fēng)險(xiǎn)更高。

2015—2017年CyHV-2陽性樣品主要分布在鹽城、泰州、南京、揚(yáng)州、徐州、鎮(zhèn)江6市（表1），均為江蘇省鯽魚的主要養(yǎng)殖區(qū)域。其中，鹽城地區(qū)CyHV-2檢出陽性數(shù)23個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于江蘇省其他鯽魚養(yǎng)殖區(qū)域，鹽城地區(qū)鯽魚異育銀鯽的養(yǎng)殖規(guī)模大，產(chǎn)量高，是江蘇省乃至全國最重要的異育銀鯽產(chǎn)區(qū)之一，因此CyHV-2在鹽城地區(qū)的流行對于江蘇省鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的危害極大。

2.2同源性結(jié)果分析

應(yīng)用MEGA軟件將測得的34個(gè)陽性序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的CyHV-2寶應(yīng)株（BY-JS1：KC841411.1）進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析比較，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，27個(gè)陽性序列與寶應(yīng)株聚在一起，7個(gè)陽性序列（均

為2015年檢出的陽性樣品）未能與寶應(yīng)株聚在一起，但遺傳距離也非常小，表明2015—2017年江蘇地區(qū)檢出的CyHV-2與江蘇地區(qū)的CyHV-2代表毒株寶應(yīng)株有極高的遺傳相似性，尚未發(fā)生明顯的變異。

3風(fēng)險(xiǎn)評估

3.1流行風(fēng)險(xiǎn)評估

鯽魚造血器官壞死病主要感染異育銀鯽[4-5，9-12]，一旦暴發(fā)則死亡率極高，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。從2015—2016年監(jiān)測結(jié)果來看，成魚感染率有明顯升高的趨勢，病原在江蘇各鯽魚主要養(yǎng)殖區(qū)已經(jīng)普遍存在，而2017年鯽魚苗種亦檢測出陽性樣品，表明無論是苗種還是成魚都可以被CyHV-2感染。由于該病毒存在潛伏感染[13]，既可以水平傳播，又能垂直傳播[14-15]，因此無論是苗種帶毒還是成魚帶毒，鯽魚感染流行的風(fēng)險(xiǎn)極高。

目前的監(jiān)測結(jié)果表明，CyHV-2只感染養(yǎng)殖鯽魚，對同池塘養(yǎng)殖的其他魚類（如草魚、青魚、鳊魚、鰱魚、鳙魚等）均不感染，查閱文獻(xiàn)也未見其他魚類感染CyHV-2發(fā)病的報(bào)道。精養(yǎng)鯽魚的塘口感染鯽魚造血器官壞死病的風(fēng)險(xiǎn)極大，近年檢出CyHV-2陽性的塘口以單養(yǎng)鯽魚為主，其他混養(yǎng)塘口則較少檢出。因此，相對于其他鯽魚養(yǎng)殖模式，精養(yǎng)鯽魚的池塘感染、流行鯽魚造血器官壞死病的風(fēng)險(xiǎn)較高，同時(shí)一旦感染發(fā)病，其經(jīng)濟(jì)損失也十分巨大。

目前江蘇鯽魚養(yǎng)殖規(guī)模十分巨大，最主要的養(yǎng)殖區(qū)域?yàn)辂}城的大豐、射陽、東臺等地，此外，揚(yáng)州、徐州、泰州、淮安、南京、無錫、常州等地也有不少鯽魚養(yǎng)殖區(qū)域。2015—2017年的CyHV-2監(jiān)測結(jié)果表明，鹽城地區(qū)的感染、流行情況最為嚴(yán)重，是鯽魚造血器官壞死病感染風(fēng)險(xiǎn)最大的區(qū)域，由于鹽城地區(qū)鯽魚養(yǎng)殖塘口高度集約，養(yǎng)殖塘口集中、連片，一旦某一個(gè)養(yǎng)殖點(diǎn)感染疾病，其傳播、蔓延風(fēng)險(xiǎn)極大，容易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，需要重點(diǎn)防控。

3.2病原變異風(fēng)險(xiǎn)評估2015—2017年CyHV-2陽性序列的同源性分析結(jié)果表明，當(dāng)前江蘇省的CyHV-2尚未發(fā)現(xiàn)明顯變異，各陽性序列與CyHV-2寶應(yīng)株（BY-JS1：KC841411.1）具有極高的同源性，來源比較單一，因此毒株基因變異的風(fēng)險(xiǎn)較小，可以針對毒株盡快進(jìn)行疫苗的研制。目前已有一些學(xué)者開展了相關(guān)疫苗研究工作，雖然免疫保護(hù)率還不夠理想[16-20]，但疫苗作為控制病毒病的最有效手段，未來有望通過滅活疫苗、減毒重組疫苗、基因工程疫苗等來達(dá)到防控CyHV-2的目的。

4討論

鯽魚是江蘇省最重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，產(chǎn)量超過63萬t，是我國鯽魚養(yǎng)殖第一大省，鯽魚因其肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受我國人民喜愛，是人們餐桌上的美味佳肴。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的急劇擴(kuò)大，各種病害頻發(fā)，經(jīng)濟(jì)損失巨大，尤其是近年來最流行的鯽魚造血器官壞死病是對鯽魚養(yǎng)殖危害最大的傳染病。該病發(fā)病急，死亡率高，幼魚和成魚均可感染，危害極大，且流行溫度范圍較廣。目前，國內(nèi)外可以對該病進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷，世界各國學(xué)者從臨床診斷、流行病學(xué)、基因組學(xué)、防控手段等方面對該病展開了一定程度的研究，但關(guān)于防控方面的研究還不夠深入，防控手段較為欠缺，CyHV-2仍未能得到有效控制。因此，對該病的發(fā)生、傳播、宿主流行情況以及病原的同源性進(jìn)行及時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)分析，找出關(guān)鍵的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，對今后的防控措施研究奠定一個(gè)基礎(chǔ)是十分必要的。

該研究結(jié)果表明，CyHV-2既能感染鯽魚成魚，也能感染苗種，而苗種攜帶病毒使得后期養(yǎng)殖過程中的疾病感染風(fēng)險(xiǎn)巨大，因此開展苗種檢疫，及時(shí)從源頭防止病毒的傳播對于防控該病是十分重要的手段；由于目前江蘇地區(qū)該病毒的毒株來源較為單一，尚未發(fā)生明顯的變異，因此針對該病毒進(jìn)行疫苗研制，將是控制該病的最有效手段。

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