陳夢璇 于立強 靖美東

摘要[目的]對我國5個地區(qū)小鼠Zfy1基因進行遺傳差異分析。[方法]通過對5個地區(qū)79個雄性小鼠樣品進行DNA提取，PCR擴增后進行序列測定和分析。使用MEGA6.0和DNAsp等軟件對獲得序列進行分析，計算遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]5個地區(qū)Zfy1基因堿基組成基本一致，堿基的平均含量為A 25.1% 、T 39.6 % 、G 20.8% 、C 14.4 %，呈現(xiàn)出明顯的AT偏向。79個樣品共定義為13個單倍型，各單倍型間遺傳距離小，無明顯差異。以大鼠（GATN01000010）為外群，小鼠（NM_009570）為參照構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，13個單倍型均處在同一分支上，無明顯分化現(xiàn)象。[結(jié)論]我國南北方各地區(qū)間小鼠Zfy1基因無明顯分化現(xiàn)象，基因差異性較小，具有極高的保守性。

關(guān)鍵詞小鼠；Y染色體；Zfy1基因；遺傳差異

中圖分類號Q75文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.023

Abstract[Objective] To analyze the genetic difference of Zfy1 gene in 5 regions of China. [Method] DNA was extracted from 79 male mouse samples in 5 regions， and the sequence was determined and analyzed after PCR amplification. MEGA6.0， DNAsp and other software were used to analyze the sequences， and the genetic distance was calculated and the phylogenetic tree was constructed. [Result] The base pair composition was consistent among 5 regions. The average contents of the bases were 25.1% A， 39.6% T， 20.8% G， and 14.4% C， showing a significant AT bias. A total of 79 samples were defined as 13 haplotypes， and there was no significant difference in genetic distance of each haplotype. The phylogenetic tree was constructed with rat GATN01000010 as the outgroup and mouse （NM_009570） as reference. 13 haplotypes were clustered into the same branch， without obvious differentiation. [Conclusion] There was no obvious differentiation of Zfy1 gene in mice from north to south in China， and the genetic difference was small， Zfy1 gene had high conservation.

Key wordsMice；Y chromosome；Zfy1 gene；Genetic difference

小鼠（Mus musculus）隸屬嚙齒目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠屬（Mus）[1]，體型較小，一般情況下其體長為70～75 mm，體重7～20 g，尾長略短于身長或與體長相當(dāng)，背部通常呈灰棕色或灰褐色，腹部毛色為白色。小鼠是一種重要的模式生物，在醫(yī)學(xué)和生物等領(lǐng)域均被廣泛利用[2-6] 。目前關(guān)于小鼠的起源及分布主要有2種模型。一種為離心模型（centrifugal model）[7]，研究者通過蛋白質(zhì)電泳線粒體DNA分析，印度及其附近地區(qū)的小鼠與歐洲和亞洲邊緣種群相比有更高水平的遺傳多態(tài)性。因此，提出小鼠起源于印度北部，然后分別向西、向北和向東幅射擴張形成M.m.domesticus、M.m.musculus和M.m.castaneus 3個亞種[7]。另一模型是在20世紀(jì)90年代末提出的，被稱為順序模型（sequential model）或線性模型（linear model）[4]，認(rèn)為原始的小鼠是domesticuslike這一亞種，起源于亞洲西部及中部這一區(qū)域。domesticuslike種群最初生活在亞洲的底格里斯河和幼發(fā)拉底河流域附近，隨著人類活動的遷徙，逐漸向南遷移到達阿拉伯半島南部地區(qū)，然后向東、向北進入亞洲印度次大陸，形成了castaneusmusculus種；最后castaneusmusculus種在亞洲大陸內(nèi)部進行了分化，形成現(xiàn)今的3個亞種[8-9]。我國小鼠主要有2個亞種：一是北方亞種（M.m.musculu），二是南方亞種（M.m.castaneu）。

哺乳動物的性別由性染色體決定，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)性染色體是由1對長度相同的染色體進化而來的[10]。在進化過程中Y染色體逐漸退化，且Y染色體上丟失的基因數(shù)量約為X染色體上的2倍[11]。Y染色體由長臂和短臂組成，長臂上逐漸形成的雄性特異區(qū)（MSY）是非重組區(qū)域，不會與X染色體發(fā)生重組，但可發(fā)生自身重組，因此Y染色體有高度進化、執(zhí)行雄性特異功能的特點[12-15]。

ZFY基因是位于Y染色體上的一個特異性基因，其作用是與X染色體上的ZFX基因構(gòu)成1對等位基因，用以編碼鋅指蛋白[16]，ZFY基因有更高的突變率、遺傳變異程度較高等特點[17-18]。20世紀(jì)80年代末，Affara等[19]通過對ZFY基因的序列分析及精確定位，提出人類Y染色體上的鋅指蛋白基因定位即小鼠Y染色體上的Zfy1和Zfy2基因，通過比對發(fā)現(xiàn)Zfy1基因與人類有較高的同源性。小鼠ZFY基因位于Y染色體短臂，包含11個外顯子和1個隨機重復(fù)區(qū)域“鋅指”結(jié)構(gòu)，“鋅指”結(jié)構(gòu)由2個組氨酸和2個半胱氨酸構(gòu)成[20-21]。在減數(shù)分裂時期，Zfy1基因在減數(shù)分裂性染色體粗線期失活，并在減數(shù)分裂性染色體失活時期起主導(dǎo)作用[21]。筆者對我國5個地區(qū)共79只雄性小鼠Zfy1基因進行序列分析與比較，以GenBank中褐家鼠（Rattus norvegicus，GATN01000010）為外群，M.m.musculus（NM_009570）為參照進行單倍型定義及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，以期為我國小鼠亞種分布及進化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集與保存

在全國多個地區(qū)使用捕鼠夾或鼠籠進行樣品采集。捕獲后的小鼠樣品根據(jù)Corbet等[22]的物種描述進行鑒定。野外采樣后，選取小鼠適量肌肉組織或剪切適量尾部保存于無水乙醇中，帶回實驗室后在低溫條件（-80 ℃）下保存。采集樣品覆蓋全國各地區(qū)，共79個小鼠樣品，每個地區(qū)樣品均在5個以上。

1.2方法

1.2.1DNA提取。

將采集的樣品組織剪取適量置于1.5 mL離心管中，充分剪碎研磨，后續(xù)使用Promega試劑盒進行總DNA的提取。使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA檢測，并將提取的DNA置于冰箱中冷凍保存，備用。

1.2.2PCR擴增。

設(shè)計引物由上海生工生物工程有限公司完成，并根據(jù)實際情況，調(diào)整退火溫度。在該試驗中通過梯度PCR確定擴增Zfy1基因的最適退火溫度為57 ℃，退火時間30 s。PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：0.5 μL模板DNA，引物各1 μL，25 μL Premix Taq，22.5 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；溫度降至室溫，10 ℃下保存。

1.2.3序列處理及分析。

將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生公進行純化與測序。將測序結(jié)果使用Chromas軟件確定使用片段。確定無誤后，使用Seqman軟件進行序列剪切與拼接。最后，將每條序列進行BLAST檢測，確定為小鼠DNA序列。利用MEGA軟件，將所有序列整合比對。利用MEGA6.0、Dnasp 4.0和DAMBE等軟件進行后續(xù)序列分析。

2結(jié)果與分析

2.1各地區(qū)堿基含量

將得到的79個序列導(dǎo)入MEGA 6.0軟件比對對齊后，剪切了609 bp的基因片段用于分析。對各地區(qū)間序列堿基組成分析結(jié)果見表1。由表1可知，在各地區(qū)間堿基差異不明顯；5個地區(qū)的樣品均表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏向，這一現(xiàn)象在以往的小鼠基因分析研究中也被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中是普遍現(xiàn)象。

2.2單倍型組成

將全部序列導(dǎo)入至DAMBE中進行單倍型定義及分析。79個樣品中共發(fā)現(xiàn)10個變異位點[variable （polymorphic） sites，V]，其中單態(tài)位點（singleton variable sites，S）3個、簡約性信息位點（parsimonyinformative sites，Pi）7個，共定義了13個單倍型，分別為H1 HN44；H2 XJ2243，XJ1374，XJ2245；H3 XJ2248；H4 XJ1358；H5 XJ1364，XJ1343，XJ1372，XJ1359，XJ1327；H6 SH40，XJ1320；H7 XJ1348，XJ1322，XJ1338，XJ2227，XJ1354，XJ1335，XJ1374，XJ1329，XJ1337，XJ1380，XJ1321，XJ1373，XJ1319，XJ1375，XJ1333，XJ1317，XJ1324，XJ1328，XJ1376，XJ1356；H8 MH58；H9 MH47；H10 MH62；H11 YM56；H11 HN29，HN24，HN40，SH15，SH2，SH6，SH30，SH33，SH26，SH4，MH56，MH50，MH51，MH43.2，YM39；H13 HN26，HN34，HN22，HN21，HN1，SH14，SH18，SH8，SH10，SH7，SH13，SH39，SH41，SH45，SH19，SH17，MH37，MH49，MH43，MH44，MH51，MH46，YM69，YM78，YM6，YM59。其中，共享單倍型有3個，分別為H6、H11、H13，主頻單倍型為H13，由26個序列組成。

2.3單倍型遺傳距離

將5個地區(qū)共79個小鼠樣品所定義的13個單倍型與GenBank中下載的小鼠Zfy1基因序列為參照，以褐家鼠序列為對比進行單倍型間遺傳距離分析。由表2可知，各單倍型間的遺傳距離較小（0.000～0.008），由此可知單倍型間小鼠Zfy1基因并沒有明顯的差異，遺傳分化較少。將5個地區(qū)間的小鼠Zfy1基因序列進行遺傳距離分析，結(jié)果見表3。由表3可知，5個地區(qū)小鼠Zfy1基因并無明顯差異，南北方小鼠并沒有出現(xiàn)明顯的遺傳分化現(xiàn)象。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹分析

Y染色體上的基因由于其特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和其本身的退化機制等原因具有較強的保守性。該研究以褐家鼠為外群，以小鼠為參照構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，13個單倍型均在同一大分支上，并沒有明顯的分支現(xiàn)象。13個單倍型均與小鼠在同一分支上，表明13個單倍型間沒有明顯的分化現(xiàn)象。

3結(jié)論

長久以來，我國小鼠的亞種分布及遷徙路線問題一直是我國小鼠相關(guān)研究者的關(guān)注熱點之一。筆者對我國南北方5個地區(qū)共 79個小鼠樣品進行DNA提取及后續(xù)序列擴增分析，發(fā)現(xiàn)擴增到的Zfy1基因序列片段在609 bp左右，79個樣本共定義了13個單倍型。各單倍型之間堿基組成差異不大，通過計算各單倍型之間遺傳距離與各地之間種群遺傳距離可知，小鼠Zfy1基因序列較為保守，并無明顯分化現(xiàn)象。以GenBank M.m.musculu的Zfy1片段為參照，以褐家鼠Zfy1基因序列為外群進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果顯示，13個單倍型均聚在同一分支上，說明由于Y染色體在進化過程中嚴(yán)格遵循父系遺傳，進化過程極度保守，我國南北方小鼠Y染色體Zfy1基因無明顯遺傳分化現(xiàn)象。

參考文獻

[1] 朱瓊?cè)铮鶓棁?，黃輝.小家鼠的研究現(xiàn)狀[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014，14（3）：392-396，401.

[2] 李菁菁，張亞平.小家鼠的遺傳與進化研究進展[J].動物學(xué)研究，2001，22（5）：406-412.

[3] PRAGER E M，SAGE R D，GYLLENSTEN U，et al.Mitochondrial DNA sequence diversity and the colonization of Scandinavia by house mice from East holstein[J].Biological journal of the linnean society，2008，50（2）：85-122.

[4] BOURSOT P，AUFFRAY J，BIRTTONDAVIDIAN J，et al.The evolution of house mice[J].Annual review of ecology & systematics，1993，24（1）：119-152.

[5] POCOCK M J O，HAUFFE H C，SEARLE J B.Dispersal in house mice[J].Biological journal of the linnean society，2005，84（3）：565-583.

[6] CORTI M，CAPANNA E，ESTABROOK G F.Micro evolutionary sequences in house mouse chromosomal speciation[J].Systematic zoology，1986，35（2）：163-175.

[7] BOURSOT P，DIN W，ANAND R，et al.Origin and radiation of the house mouse：Mitochondrial DNA phylogeny[J].Journal of evolutionary biology，1996，9（4）：391-415.

[8] GERALDES A，BASSET P，GIBSON B，et al.Inferring the history of speciation in house mice from autosomal，Xlinked，Ylinked and mitochondrial genes[J].Molecular ecology，2008，17（24）：5349-5363.

[9] BOHLING J H，WAITS L P.Assessing the prevalence of hybridization between sympatric Canis species surrounding the red wolf（Canis rufus）recovery area in North Carolina[J].Molecular ecology，2011，20（10）：2142-2156.

[10] 蘇瑩，鞠貴春，邵元臣，等.利用Y染色體進行鹿科動物的起源和進化分析[J].特產(chǎn)研究，2016，38（1）：53-57.

[11] 王金鵬，楊曉瑩，于立強，等.3個群體小家鼠Sry基因序列分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（11）：114-116.

[12] 沈紅霞，尹坤.大理地區(qū)男性Y染色體多態(tài)性與臨床效應(yīng)關(guān)系探討[J].大理大學(xué)學(xué)報，2016，1（8）：65-66.

[13] 朱運良，伍新堯.Y染色體MSY區(qū)域內(nèi)DNA分子重組[J].國外醫(yī)學(xué)（遺傳學(xué)分冊），2004，27（5）：276-278.

[14] 蔣虎.人類性染色體DNA回文序列分析[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2011.

[15] 徐健.中國小家鼠線粒體全基因組序列分析[D].煙臺：魯東大學(xué)，2014.

[16] 張永生，席繼鋒，王香祖，等.Zfy 基因與哺乳動物性別控制研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)，2016，48（12）：105-108.

[17] GERRARD D T，F(xiàn)ILATOV D A.Positive and negative selection on mammalian Y chromosomes[J].Molecular biology and evolution，2005，22（6）：1423-1432.

[18] JEGALIAN K，PAGE D C.A proposed path by which genes common to mammalian X and Y chromosomes evolve to become X inactivated[J].Nature，1998，394（6695）：776-780.

[19] AFFARA N A，CHAMBERS D，OBRIEN J，et al.Evidence for distinguishable transcripts of the putative testis determining gene（ZFY）and mapping of homologous cDNA sequences to chromosomes X，Y and 9[J].Nucleic acids research，1989，17（8）：2987-2999.

[20] MITCHELL M，SIMON D，AFFARA N，et al.Localization of murine X and autosomal sequences homologous to the human Y located testis-determining region[J].Genetics，1989，121（4）：803-809.

[21] DECARPENTRIE F，VERNET N，MAHADEVALAH S K，et al.Human and mouse ZFY genes produce a conserved testis-specific transcript en-coding a zinc finger protein with a short acidic domain and modified transactivation potential[J].Human molecular genetics，2012，21（12）：2631-2645.

[22] CORBET G B，HILL J E.A world list of mammalian species[M].3rd ed.Oxford：Oxford University，1991.