黎慧 闞霞 魏寧

摘要 [目的] 建立高效實(shí)用的水樣環(huán)境DNA提取方案。[方法] 采用濾膜法和沉淀法對(duì)2個(gè)不同大小的水域進(jìn)行eDNA提取并對(duì)所獲得的eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，濾膜法設(shè)置50、100、200 mL 3個(gè)水樣體積試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行；沉淀法設(shè)置10、20、40 mL 3個(gè)水樣體積試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行。[結(jié)果] 大型水塘水樣經(jīng)濾膜法處理后獲得的eDNA濃度更高；小型水池采用濾膜法和大型水塘采用沉淀法處理水樣后經(jīng)PCR檢測(cè)可獲得更明顯的擴(kuò)增結(jié)果。[結(jié)論]該研究建立的濾膜法和沉淀法可用于不同水環(huán)境eDNA的提取。

關(guān)鍵詞 環(huán)境DNA提?。凰h(huán)境；濾膜法；沉淀法

中圖分類(lèi)號(hào) S181 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）09-0108-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.032

Abstract [Objective] To establish an efficient and practical method for extracting environmental DNA （eDNA） from water sample.[Method]Using the filter membrane or precipitation method to extract eDNA from two different sizes of water body and conducting PCR amplification to detect the quality and quantity of eDNA.Four groups were set with different water volume 50，100，200 mL and negative control in filter membrane method.And the other four groups with water samples 10，20，40 mL and negative control were set in precipitation method.All groups have three parallel samples.[Result]The concentration of eDNA extracted by the filter membrane method from the large water body was higher than others.The eDNA from small and large water body handled by the filter membrane and precipitation methods respectively can be detected significantly by PCR amplification.[Conclusion]The methods used in this study can be applied to eDNA extraction in different water bodies.

Key words Environmental DNA extraction； Water sample； Filter membrane method； Precipitation method

環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指從環(huán)境樣本中如土壤、沉積物、空氣、水體等所提取到的DNA[1]。它是來(lái)自微生物、動(dòng)物、植物等多個(gè)不同物種的混合DNA，既包含了從生物體脫落或釋放到環(huán)境中活細(xì)胞的DNA，也包括由于生物體死亡后的腐爛尸體所裂解釋放到環(huán)境中的胞外DNA[2]。與傳統(tǒng)方法相比，環(huán)境 DNA法僅需從目標(biāo)研究物種潛在分布區(qū)域中采集土壤或水樣等物質(zhì)，而不需要捕捉、干擾或傷害動(dòng)物體，故該方法被廣泛地應(yīng)用于外來(lái)入侵物種的監(jiān)測(cè)[3-4]和珍稀瀕危動(dòng)物的分布調(diào)查[5]；其次，由于環(huán)境DNA是多個(gè)物種的混合DNA，因此該方法也常被應(yīng)用于生物多樣性的研究[6-7]。近年來(lái)，隨著環(huán)境DNA技術(shù)的逐漸成熟和發(fā)展，環(huán)境 DNA還被用于水生生物量的估計(jì)[8-9]、動(dòng)物的食性分析[10]、種群大小[11]和種群動(dòng)態(tài)[12]等方面的研究。

水樣作為環(huán)境DNA研究的樣本類(lèi)型之一，其主要分析步驟為水樣的采集與保存、水環(huán)境eDNA的提取、水環(huán)境eDNA的分析。其中，水環(huán)境eDNA的提取非常關(guān)鍵，已有研究顯示不同的水樣采集方法和提取方法對(duì)eDNA的產(chǎn)量和質(zhì)量影響顯著[13]。當(dāng)前，通常采用試劑盒法、濾膜法或沉淀法來(lái)進(jìn)行環(huán)境DNA的提取。其中，試劑盒法提取的環(huán)境DNA質(zhì)量和產(chǎn)量均較好，然而由于其成本相對(duì)較高，因此不適用于對(duì)大規(guī)模的樣本開(kāi)展研究。筆者分別采用濾膜法和沉淀法對(duì)大型水塘和小型水池中的環(huán)境DNA進(jìn)行提取，比較了所得eDNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，并據(jù)此建立了高效實(shí)用的水環(huán)境eDNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 水樣采集及處理

選取某大型水塘（約560 m2）和某小型水池（約6 m2）作為該研究水樣的采集地點(diǎn)。大型水塘除面積較大外，還生活著多種魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和植物；小型水池面積較小，總體呈長(zhǎng)方形，水質(zhì)較清澈，基本無(wú)動(dòng)植物分布。

大型水塘水樣的采集：繞湖一周，隨機(jī)選取20個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)取表層水約100 mL，然后混勻倒入同一個(gè)容器后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

小型水池水樣采集：選取水池的4個(gè)角和水池中央部分表層水進(jìn)行采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)約取400 mL，將水樣混勻后倒入同一個(gè)容器帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

將2個(gè)采樣地點(diǎn)的水分成2部分，一部分用于濾膜法提取eDNA，一部分用于沉淀法提取eDNA。水樣的具體分組情況見(jiàn)表1。

1.2 水環(huán)境eDNA提取

1.2.1 濾膜法。

用孔徑為0.45 μm的混合纖維素濾膜（上海市新亞凈化器件廠(chǎng)）抽濾各組水樣。每次抽濾結(jié)束后，用無(wú)菌的鑷子取出濾膜，折疊卷緊后剪碎放入2 mL離心管中，加入900 μL DNA抽提液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL）于56 ℃恒溫水浴過(guò)夜。隨后12 000 r/min離心5 min，吸取400 μL上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2 mL離心管中，用等體積酚/氯仿/異戊醇 （25∶24∶1） 抽提2次，10 000 r/min離心10 min，將300 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的2 mL離心管中，加入0.6倍體積異丙醇室溫沉淀1 h，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，在沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r/min離心10 min，棄上清，待乙醇揮發(fā)后加入30 μL TE溶解DNA。

1.2.2 沉淀法。

將各組水樣置于4 000 r/min下離心15 min，棄上清，僅余1 mL上清液懸浮沉淀，吹打混勻后轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，在管中加入900 μL DNA抽提液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），后續(xù)DNA提取方法同“1.2.1”。

1.3 環(huán)境DNA檢測(cè) 以提取的各組eDNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）[14]對(duì)eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，整個(gè)PCR操作過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含2.0 mmol/L的MgCl2，0.25 mmol/L的dNTP，0.2 μmol/L的上下游引物，1 U的Taq聚合酶，模板DNA 0.8 μL，10×Buffer 2 μL，雙蒸水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火40 s；72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃下延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組eDNA提取結(jié)果

經(jīng)濾膜法和沉淀法處理后的環(huán)境水樣在eDNA的提取結(jié)果中存在明顯的差異（圖1）。對(duì)于大型水塘采用濾膜法處理后的3個(gè)試驗(yàn)組分別在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中得到了明顯的目的條帶，而在其他試驗(yàn)組以及4個(gè)對(duì)照組中均沒(méi)有明顯的目的條帶。說(shuō)明在大型水塘中采用濾膜法可很好地富集水樣中的DNA，且DNA的濃度相對(duì)較高。

2.2 環(huán)境DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)濾膜法和沉淀法處理后的環(huán)境水樣，在相同的eDNA提取步驟后，細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果有明顯的不同。小型水池采用濾膜法和大型水塘采用沉淀法處理的水樣其3個(gè)試驗(yàn)組在PCR擴(kuò)增后均可見(jiàn)明顯的目的條帶；小型水池采用沉淀法處理后僅在40 mL水樣組中有目的條帶出現(xiàn)，且其擴(kuò)增結(jié)果并不穩(wěn)定（2/3樣本可見(jiàn)目的擴(kuò)增條帶）；大型水塘采用濾膜法處理的水樣，其3個(gè)試驗(yàn)組均沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶。此外4個(gè)空白對(duì)照組和4個(gè)PCR陰性對(duì)照均沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照有明顯的目的條帶（圖2）。

3 結(jié)論與討論

在當(dāng)前，環(huán)境DNA因其具有采樣容易、分析簡(jiǎn)單、試驗(yàn)操作方便等特點(diǎn)而在保護(hù)生物學(xué)、生物多樣性和入侵生物學(xué)的研究中得到廣泛的應(yīng)用。該研究通過(guò)應(yīng)用濾膜法和沉淀法對(duì)大型水塘和小型水池的環(huán)境DNA提取方法進(jìn)行了探討，并據(jù)此建立了完整的eDNA提取方案。

研究中對(duì)環(huán)境DNA的直接電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大型水塘內(nèi)的eDNA含量高于小型水池。不同水體中由于生活的生物體不同，其水樣中的eDNA含量也有所差異[15]。該研究的大型水塘內(nèi)由于生活著魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、植物等多種生物體，因而其水樣中的eDNA含量相對(duì)小型水池的水樣較高。此外，進(jìn)一步用細(xì)菌16S rDNA通用引物來(lái)檢測(cè)eDNA的質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大型水塘中用濾膜法所提取到的濃度較高的eDNA在細(xì)菌的檢測(cè)中未能有擴(kuò)增結(jié)果，而采用沉淀法獲得的eDNA在細(xì)菌PCR中可獲得較好的擴(kuò)增條帶。環(huán)境DNA是一種混合DNA，也是各種生物體留在水樣中的DNA，在進(jìn)行環(huán)境DNA提取過(guò)程中，可能會(huì)殘留PCR抑制物，因此在用eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)很可能會(huì)出現(xiàn)PCR抑制[16]。由于濾膜法所獲得的eDNA濃度要高于沉淀法，這可能導(dǎo)致濾膜法獲得的eDNA由于存在更多抑制因子而造成擴(kuò)增失敗。在對(duì)小型水池的eDNA細(xì)菌PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小型水池的水樣在濾膜法和沉淀法處理后不能直接通過(guò)電泳檢測(cè)到eDNA的含量，但經(jīng)濾膜法提取的eDNA在細(xì)菌PCR中檢測(cè)到了擴(kuò)增產(chǎn)物。這個(gè)結(jié)果的出現(xiàn)可能是由于小型水池中的環(huán)境DNA本來(lái)就很少，濃度很低，而濾膜法相對(duì)沉淀法能夠更好的富集eDNA。

此外，在環(huán)境DNA的研究中，在環(huán)境水樣采集后對(duì)水樣的保存也是影響eDNA產(chǎn)量和質(zhì)量的一個(gè)重要因素。該研究由于采樣點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)室距離較近，所以并未對(duì)采集的水樣進(jìn)行前處理。但如果采樣點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)室距離較遠(yuǎn)，可通過(guò)在水樣中添加緩沖液，如每15 mL水樣中加入1.5 mL 3 mol/L的醋酸鈉和33 mL無(wú)水乙醇等方法對(duì)水樣進(jìn)行保存。在濾膜法中濾膜的選擇上也有很多種，如醋酸纖維濾膜、混合纖維濾膜、尼龍膜、玻璃纖維濾膜等，但已有研究表明，不同的濾膜具有不同的DNA回收率，其中混合纖維濾膜的回收效果最佳[17]。

該研究采用濾膜法和沉淀法對(duì)大型水塘和小型水池的eDNA進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法均可以提取到eDNA。但就試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，濾膜法相對(duì)于沉淀法可獲得濃度更高的eDNA，因此建議在生物量較高的水體中采用沉淀法來(lái)處理水樣，而在生物量較低的水體中則推薦使用濾膜法。

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