王曉娟，李 娟，李 周

（1.洛陽市第二中醫(yī)院，河南 洛陽 471003；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006）

復方雷公藤處方由雷公藤、川芎、炙乳香和炙沒藥等中藥組成，是用于治療類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的臨床經(jīng)驗處方，其中雷公藤為方中主藥。雷公藤已經(jīng)廣泛用于RA等免疫系統(tǒng)疾病的治療，療效確切，幾乎沒有可以替代的中藥［1-2］，但是雷公藤具有較大的毒性，且有效劑量和中毒劑量接近，口服雷公藤制劑容易因為劑量問題而造成毒副反應［3］，為了減少雷公藤口服給藥所造成的毒性反應，本課題組擬將復方雷公藤開發(fā)成經(jīng)皮給藥制劑——微乳凝膠。微乳凝膠（microemulsion based gels，MBGs）是近十幾年來興起的一種新劑型，它是由油相、表面活性劑和助表面活性劑組成的透明、均一的熱力學穩(wěn)定體系［4］。微乳能增加藥物的溶解度和經(jīng)皮滲透性，延長藥物作用時間［5］，但是微乳的流動性強，黏附性差。因此，為了適合經(jīng)皮給藥，通常將微乳進一步制成微乳凝膠。本研究以雷公藤中主要有效成分之一的雷公藤甲素為指標，對復方雷公藤微乳凝膠體外釋放度進行了考察，同時比較了復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠以及復方雷公藤巴布劑的體外透皮特性，為將復方雷公藤處方開發(fā)成微乳凝膠提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 TK-12A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司，515泵，2487紫外檢測器）；N3000色譜工作站（浙江大學）；AUW120D十萬分之一分析天平（日本島津）；DLB200電子天平（日本島津）。

1.2 試藥與試劑 復方雷公藤提取物（雷公藤甲素的含量為0.128%，實驗室自制）；透析袋（MWCO：8 000～14 000，上海金穗生物科技有限公司）；油酸（廣州化學試劑廠）；OP乳化劑（天津市福晨化學試劑廠）；卡波姆940（CP-940，廣州化學試劑廠）；三乙醇胺（廣州化學試劑廠）；無水乙醇（天津市百世化工有限公司）；壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯（廣州化學試劑廠）；乳酸（魚臺海納環(huán)?？萍加邢薰荆?；殼聚糖（濟寧佰一化工有限公司）；卡拉膠（深圳安泰生物科技有限公司）；雷公藤甲素標準品（成都普菲德生物技術有限公司，批號：140424）；甲醇（色譜純，迪馬公司）；水為蒸餾水；其它試劑均為分析純。

1.3 動物 健康雌性昆明種小鼠，體質(zhì)量20±2 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。

2 方法與結(jié)果

2.1 復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠、復方雷公藤巴布劑的制備

2.1.1 復方雷公藤微乳凝膠的制備 經(jīng)前期預試驗確定復方雷公藤微乳凝膠的制備方法：在室溫下取復方雷公藤提取物1.5 g加入到1.58 g油酸中超聲溶解，然后加入壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯7.58 g、OP乳化劑1.89 g、無水乙醇4.73 g，超聲攪拌均勻，在磁力攪拌器作用下逐滴加入80.72 g水，攪拌0.5 h，即得復方雷公藤微乳；將2 g卡波姆940加入到制備好的復方雷公藤微乳中，溶脹24 h，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH6～7，攪拌均勻，即得復方雷公藤微乳凝膠，載藥量為1.5%。

2.1.2 復方雷公藤凝膠的制備 取2 g卡波姆940用適量蒸餾水進行溶脹，再取1.5 g復方雷公藤提取物用10 ml乙醇進行溶解，加入5 g甘油，混合均勻后一并加入到卡波姆940溶液中，攪拌均勻后，加入三乙醇胺調(diào)節(jié)pH6～7，加水至100 g，制備得載藥量為1.5%的復方雷公藤凝膠。

2.1.3 復方雷公藤巴布劑的制備 參考專利“雷公藤巴布劑的制備方法（公開號：CN102008536A）”［6］制備復方雷公藤巴布劑，具體制備方法如下：將0.15 g乳酸加水15 ml混勻，然后加入0.75 g殼聚糖，加熱至40～65℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為A相；將18 g聚乙烯醇加水24 ml，加熱至55～80℃溶解，攪拌均勻，作為B相；將1.5 g明膠加水12 ml，加熱至40～60℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為C相；將12 g聚乙烯毗咯烷酮和3 g卡拉膠加水33 ml，加熱至40～60℃攪拌使完全溶解，并混合均勻，作為D相。將A、B兩相混合，在40～65℃下攪拌依次加入C相和D相，然后加入12 g甘油，在40～60℃溫度下混勻即得巴布劑基質(zhì)。取1.5 g復方雷公藤提取物加入到上述方法制備好的基質(zhì)中，攪拌數(shù)分鐘，涂布，即得復方雷公藤巴布劑，巴布劑最終大載藥量為1.2%。

2.2 雷公藤甲素的含量測定

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取雷公藤甲素2.23 mg置于10 ml的量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖即得濃度為223μg/ml的雷公藤甲素對照品貯備液。

2.2.2 陰性樣品溶液的制備 將無水乙醇與生理鹽水按4∶6的比例混合均勻，即得陰性樣品（空白接收液）。

2.2.3 供試品溶液的制備 體外釋放度試驗供試品溶液的制備：取雷公藤微乳凝膠擴散池接收液，過0.22μm微孔濾膜，即得。體外透皮試驗供試品溶液的制備：取復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠及復方雷公藤巴布劑體外透皮接收液，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 色譜條件色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（45∶55），流速為1.0 ml/min，檢測波長為218 nm，進樣量為10 μl，柱溫為25℃。理論塔板數(shù)按雷公藤甲素峰計算應不低于4 000，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.5 標準曲線的制備 將雷公藤甲素對照品貯備液進行倍比稀釋，得到雷公藤甲素濃度為0.112μg/ml、0.223 μg/ml、0.446 μg/ml、1.115 μg/ml、2.23 μg/ml、4.46 μg/ml、8.92 μg/ml的對照品系列溶液，按照2.2.4項下色譜條件依次進樣，進樣量為10μl，以峰面積（Y）對對照品濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=13 978X+9 560.5，r=0.999 9，說明雷公藤甲素在0.112～19.84μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取8.92μg/ml的對照品溶液10μl，連續(xù)重復進樣6次，測得雷公藤甲素峰面積并計算其RSD值。結(jié)果RSD為1.12%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 將2.2.3項下所制備的供試品溶液置于冷藏（0～4℃）、避光條件下儲存，取同一供試品溶液，按照2.2.4項下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 進樣，進樣量為10 μl，測定峰面積并計算其RSD值。結(jié)果RSD為1.37%（n=7），表明雷公藤甲素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 體外釋放度試驗［7-8］采用改良Franz擴散池進行實驗，擴散池容積為8 ml，有效擴散面積為3.14 cm2。將已處理過的半透膜置于供給池和接收池之間，供給池中均勻涂抹復方雷公藤微乳凝膠1 g，供給池上端用封口膜封口以免雜質(zhì)掉落，接收室中加入已超聲脫氣的乙醇-生理鹽水（4∶6），將供給池與接收池用鐵夾固定，縫隙用石蠟密封，防止同批擴散池水浴中的水進到供給池中。調(diào)節(jié)溫度至32±0.5℃，恒速攪拌（約200 r/min），分別于實驗開始后的1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h從樣品接收室吸取1 ml接收液，同時向接收室中補加同溫度同體積的空白接收液。將所吸取的接收液用0.22μm微孔濾膜過濾后，按2.2.4項下色譜條件進樣分析，并按下式計算累計滲透量（Qn）、滲透速率常數(shù)（J），并計算累計釋放率（R）。

式中，Qn：第n個時間點的累計面積透過量（μg/cm2）；V：接收室中接收液的總體積（8 ml）；Vi：每次的取樣體積（1 ml）；Cn：第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度（μg/ml）；A：有效擴散面積（3.14 cm2）；J：釋放速率常數(shù)/透皮速率常數(shù)［μg/（cm2·h）］，M為1 g復方雷公藤微乳凝膠中的雷公藤甲素的量，即19.22μg。

求得累積滲透量之后，將累積滲透量Q對時間t進行方程擬合，并求得回歸系數(shù)r，回歸系數(shù)最大的方程即為最佳擬合方程，分別有下列三種方式：零級方程 Q=at+b；一級方程 lnQ=at+b；Higuchi方程Q=at1/2+b，結(jié)果見表1。

表1 雷公藤甲素釋放度方程的擬合 （n=3）

從表1可以看出，根據(jù)回歸系數(shù)r可知，雷公藤甲素在復方雷公藤微乳凝膠中釋藥特性符合零級釋藥方程Q=1.25t+2.67，即藥物沒有突釋也沒有迅速釋放（一級方程），而是基本上以恒定的速率釋藥，釋藥速率為1.25μg/（cm2·h）；雷公藤微乳凝膠在12 h內(nèi)的累積釋藥量達到91%，釋藥較完全。復方雷公藤微乳凝膠符合經(jīng)皮給藥制劑釋放度的要求。

2.4 體外透皮實驗［9］

2.4.1 離體鼠皮的制備與保存 取健康小鼠，用電動

剃毛機剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化鈉溶液對剩余的毛發(fā)進行脫除，兩天后小鼠脫臼處死，小心剝離腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織及粘連物，用生理鹽水反復沖洗干凈，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄒ粋€星期內(nèi)使用完）。實驗前自然解凍，每次實驗前檢查皮膚的完整性，不能有任何破損。

2.4.2 透皮實驗方法 參照2.3項下體外釋放度試驗方法進行，將供給池和接收池之間的屏障由半透膜換成離體小鼠腹部皮膚，角質(zhì)層朝上（供給池），分別將復方雷公藤微乳凝膠1 g、復方雷公藤凝膠1 g和復方雷公藤巴布劑0.8 g均勻涂抹于小鼠皮膚之上，開始進行體外透皮試驗，測得不同制劑不同時間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h）接收池中雷公藤甲素藥物濃度，并計算累積透皮量，同時對時間進行回歸，求得Q-t方程，以透皮速率為指標比較復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠和復方雷公藤巴布劑三者的透皮性能，結(jié)果如表2、圖2。

表2 不同制劑中雷公藤甲素經(jīng)皮滲透實驗結(jié)果 （±s，n=3）

表2 不同制劑中雷公藤甲素經(jīng)皮滲透實驗結(jié)果 （±s，n=3）

制劑復方雷公藤微乳凝膠復方雷公藤凝膠復方雷公藤巴布劑經(jīng)皮滲透回歸曲線Q=0.419t+0.917 Q=0.205t+0.093 Q=0.253t+0.040 Q24 h（μg/cm2）11.24±1.03 4.94±0.26 6.12±0.42 J［μg/（cm2·h）］0.419 0.205 0.253

圖2 不同制劑中雷公藤甲素經(jīng)皮滲透Q n對t曲線

從表2和圖2可知，復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤巴布劑、復方雷公藤凝膠24 h的體外累積透皮量與時間的曲線方程分別為Q=0.419t+0.917、Q=0.253t+0.040、Q=0.205t+0.093，其中復方雷公藤微乳凝膠的透皮速率為0.419μg/（cm2·h），均大于復方雷公藤巴布劑［0.253μg/（cm2·h）］和復方雷公藤凝膠［0.205μg/（cm2·h）］，表明復方雷公藤微乳凝膠體外透皮特性優(yōu)于復方雷公藤凝膠劑和復方雷公藤巴布劑，適合開發(fā)成經(jīng)皮給藥制劑。

3 討 論

本試驗研究中，透皮擴散池的接收液為40%乙醇溶液（乙醇∶水為4∶6），是因為在預實驗中發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素在40%乙醇溶液中溶解度較好，在進行透皮擴散試驗時符合漏槽條件，因此選擇其作為透皮擴散試驗的接收液；在2.4.2項體外透皮試驗中，復方雷公藤微乳凝膠、復方雷公藤凝膠與復方雷公藤巴布劑給藥量有所不同，這是因為復方雷公藤巴布劑的載藥量與前兩者不同，為了保證給藥量中雷公藤甲素的含量一致，因此調(diào)整了復方雷公藤巴布劑的給藥量。采用硫化鈉對小鼠皮膚進行脫毛時，由于硫化鈉具有較強的堿性，會對皮膚角質(zhì)層造成一定程度上的破壞，從而改變皮膚對藥物的透過性，因此，本實驗在用硫化鈉對小鼠腹部皮膚脫毛后，要過兩天再取小鼠皮膚，目的是讓小鼠皮膚自然恢復。

研究表明，復方雷公藤微乳凝膠體外釋放速率為1.25μg/（cm2·h），遠大于其透皮速率0.419μg/（cm2·h），因此復方雷公藤微乳凝膠的釋放不是其透皮速率的限速環(huán)節(jié)，其釋放行為符合零級方程，即可以達到平穩(wěn)緩慢釋藥，一方面不會由于快速釋藥而導致透皮吸收過快、體內(nèi)藥物濃度過高而造成毒性反應，另一方面可以維持較久的給藥時間，無需頻繁給藥，因此滿足經(jīng)皮給藥制劑的要求。復方雷公藤微乳凝膠透皮特性優(yōu)于復方雷公藤凝膠和復方雷公藤巴布劑，說明了微乳可以促進藥物的經(jīng)皮吸收，加之巴布劑的成型工藝復雜，因此復方雷公藤處方更適合開發(fā)成微乳凝膠。