袁德俊，吳 涵，梁馨文，黃曉冰

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510240；2.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東 廣州 510520）

廣東王不留行為桑科植物薜荔（Ficuspumila L.）的干燥癮頭花序托，別名為薜荔果、木蓮、絡(luò)石藤、風(fēng)不動、常春藤等，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南、江西等地，具有祛風(fēng)利濕、活血解毒的功效，用于風(fēng)濕痹痛、瀉痢、淋病、跌打損傷、癰腫瘡癤的治療［1］。《中華人民共和國藥典》記載的王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vacaria Segetalis（Neck）Carcke的干燥成熟種子 ，具有活血通經(jīng)、下乳消腫的功效，主治痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后乳汁不下及乳癰腫痛等［2］，是全國使用和流通的王不留行的正品。然而，廣東、廣西等地區(qū)習(xí)慣將廣東王不留行當(dāng)作王不留行使用［3］，事實上兩者在來源、用藥部位及功效等方面差異都較大。有關(guān)廣東王不留行化學(xué)成分的文獻(xiàn)研究不多，有報道其花序托含蘆丁、內(nèi)消旋肌醇、蕓香苷、β-谷甾醇等成分［1］，曾頌等［4-5］學(xué)者對其槲皮素、蘆丁和綠原酸的含量進(jìn)行了測定。為對廣東王不留行的藥材質(zhì)量進(jìn)行更深入的研究，本研究采用HPLC同時測定廣東王不留行中蘆丁和綠原酸的含量，并對不同批次、不同廠家的含量進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津，型號為LC-20AT）；紫外可見分光光度計（北京普析公司，型號為TU-1901）；電子天平（北京普析公司，型號為MSE125P-OCE-DU）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量為96.8%，批號：110753-201817）；蘆丁對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98%，批號：L-001-170426）；乙腈（色譜純）；其余試劑均為分析純。10批次廣東王不留行批號及收集地分別為：1608001（嶺南）、170304001（清平市場）、170301（至信）、1705001（嶺南）、170304002（清平市場）、1701001（嶺南）、170304003（清平市場）、160801（至信）、161101（至信）、1808001（嶺南），產(chǎn)地均為廣東，經(jīng)吳康郁副主任中藥師鑒定為?？浦参镛道蟮母稍锇a頭花序托的炮制加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.50 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為蘆丁對照品儲備液（228μg/ml）；精密稱取綠原酸對照品5.48 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品儲備液（219μg/ml）。精密量取上述儲備液各1 ml置于5 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻即得混合對照品溶液（蘆丁和綠原酸濃度分別為45.6 μg/ml、43.8 μg/ml）。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約1.00 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SPC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫的情況見表1；紫外檢測器波長：251 nm；液相色譜柱溫度：30℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10μl；理論板數(shù)按蘆丁峰計應(yīng)不低于3 000［6］。精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果蘆丁和綠原酸與其他成分能得到較好的分離，其分離度均大于1.5。見圖1。

表1 流動相梯度洗脫條件

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取上述綠原酸對照儲備液 0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml和上述蘆丁對照儲備液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分別置于對應(yīng)5個10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋定容至刻度，搖勻，即得各混合對照品系列溶液。分別精密吸取上述各混合對照品系列溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述含量測定方法測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制綠原酸和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸的回歸方程為：Y=12 171X-6 537（r2=0.9993）；蘆丁的回歸方程為：Y=17 196.1X-2 315.36（r2=0.9995）。綠原酸和蘆丁分別在9.60～76.80μg/ml和4.08～20.40μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取10μl綠原酸和蘆丁的混合對照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定峰面積，測得綠原酸的峰面積RSD為1.23%（n=6），蘆丁的峰面積RSD為1.06%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按上述含量測定方法，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h取10 μl樣品進(jìn)樣測定，同時記錄不同時間下對應(yīng)的峰面積，并根據(jù)峰面積計算出樣品中綠原酸和蘆丁的濃度。結(jié)果顯示綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.45%（n=7）和0.46%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 選取同一批廣東王不留行藥材（批號：161101）6份，按2.2項方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl測定峰面積，計算含量，結(jié)果綠原酸平均含量為45.79 μg/ml，RSD為1.89%（n=6）；蘆丁平均含量為7.05μg/ml，RSD為2.27%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗 取6份廣東王不留行供試品（含量已知），分別稱取1.00 g，并加入不同質(zhì)量的綠原酸和蘆丁對照品，在2.1色譜條件下每個樣品重復(fù)測定3次計算樣品的回收率，見表2。

表2 綠原酸、蘆丁加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.9 綠原酸、蘆丁的含量測定 取不同收集地、不同批次的廣東王不留行樣品，按2.2方法制備供試品溶液，并按2.3色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3和表4。

3 討 論

本實驗通過比較不同比例的流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），發(fā)現(xiàn)按表1所示比例進(jìn)行梯度洗脫，能使廣東王不留行中綠原酸和蘆丁得到較好的分離效果。此外，超聲提取法提綠原酸和蘆丁較煎煮法、乙醇回流法在操作上更簡便，且提取率較高［7］。

通過對綠原酸和蘆丁的含量測定，不同收集地、不同批次的綠原酸含量差異不大，而蘆丁的含量差異較大，可能與產(chǎn)地、貯藏、炮制工藝有關(guān)。相同收集地的不同批次樣品的綠原酸平均含量相比較，嶺南＞至信＞清平市場；而蘆丁平均含量相比較，至信＞嶺南＞清平市場，這可能與藥材采收季節(jié)、果實的成熟度不一致有關(guān)。

廣東王不留行是嶺南常用藥材，尚未收錄在《中華人民共和國藥典》，本實驗建立了該藥材中蘆丁和綠原酸的含量測定方法，該方法快捷、準(zhǔn)確，可為完善廣東王不留行的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

表3 不同批次樣品中綠原酸、蘆丁的含量比較 （μg/ml）

表4 相同收集地的不同批次樣品中綠原酸、蘆丁的含量比較 （μg/ml）