劉然,左利,劉士蒙,楊桂英,李詩(shī)雅,呂昌銀

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,衡陽(yáng)市健康危害因子檢驗(yàn)檢疫新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421000)

尿酸是嘌呤核苷酸分解代謝的終產(chǎn)物[1],人體血清中尿酸水平的正常范圍為130～460 μmol/L[2]。尿酸異常是嘌呤代謝相關(guān)疾病的反映[3]。目前,人血尿酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、電化學(xué)法和熒光法等,這些方法雖然都較靈敏,但儀器昂貴、操作復(fù)雜[4]。當(dāng)前,仍需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靈敏簡(jiǎn)便、成本低廉的尿酸檢測(cè)新技術(shù)。

本研究利用尿酸氧化酶選擇性催化尿酸氧化產(chǎn)生H2O2后,用金屬硫蛋白銅納米簇(MT-CuNCs)的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性催化H2O2與色源底物3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色反應(yīng),實(shí)現(xiàn)比色/光度法準(zhǔn)確檢測(cè)人血清尿酸。該方法簡(jiǎn)便靈敏、選擇性好、成本低廉,能夠滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

金屬硫蛋白銅納米簇,自制；尿酸、尿酸酶、3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙酸鈉均為分析純；超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)。

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),狹縫1 nm(用于獲取體系的吸收光譜)。

1.2 MT-CuNCs的制備

取600 μL 2.25 mg/mL金屬硫蛋白溶液,置于100 μL 3 mol/L氯化銅溶液中,55 ℃恒溫,振蕩混勻15 min后,加入1.0 mol/L NaOH溶液200 μL,持續(xù)恒溫混勻12 h。溶液顏色從淺藍(lán)色變?yōu)闇\紫色。制備所得的MT-CuNCs經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后,在4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理

尿酸氧化酶特異性催化尿酸氧化產(chǎn)生H2O2[5],MT-CuNCs具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性,可催化其表面的H2O2生成·OH[6]。強(qiáng)氧化性的·OH氧化DAB形成棕色的DBTD聚集體[7]。在一定濃度范圍內(nèi),可通過(guò)測(cè)定體系顏色深淺或465 nm處的吸光度值的變化定量檢測(cè)尿酸濃度。

圖1 比色/光度法測(cè)定尿酸的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the principle of colorimetric/photometric determination of uric acid

1.4 尿酸的檢測(cè)

在一系列2 mL的EP管中,依次加入80 μL 10 mmol/L pH=7.0 Tris-HCl緩沖液,再分別加入不同量的尿酸溶液,70 μL 200 μg/mL尿酸酶溶液,混合均勻后孵育30 min使其充分反應(yīng),產(chǎn)生H2O2。隨后,依次加入100 μL 200 mmol/L pH=5.0 NaAc-HAc,40 μL MT-CuNCs,40 μL 5 mmol/L DAB,混勻,在37 ℃下恒溫孵育30 min后,在λe=465 nm處分別測(cè)定加入了尿酸各溶液的吸收光譜(A),測(cè)定未加入尿酸溶液的吸收光譜(A0),計(jì)算吸收光譜的變化值ΔA=A-A0。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特征

由圖2可知,DAB溶液對(duì)400 ～ 650 nm的光無(wú)吸收；在UOx+MT-CuNCs+DAB測(cè)定體系中不存在尿酸,MT-CuNCs通過(guò)其氧化酶活性,催化溶液中的溶解氧氧化DAB,但催化氧化能力弱,產(chǎn)生的DBTD少,棕色聚集體量少,吸光度值增加,但變化小。在UA+UOx+MT-CuNCs+DAB測(cè)定體系中,由于存在尿酸,尿酸氧化酶特異性催化尿酸氧化產(chǎn)生H2O2,MT-CuNCs的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性,催化其表面的H2O2生成強(qiáng)氧化性的·OH,對(duì)DAB的氧化能力強(qiáng),將DAB氧化產(chǎn)生棕色聚集體,吸光度值增加,變化大。H2O2+MT-CuNCs+DAB測(cè)定體系A(chǔ)-λ曲線與UA+UOx+MT-CuNCs+DAB測(cè)定體系的A-λ曲線具有相同的輪廓和吸收峰,驗(yàn)證了MT-CuNCs對(duì)DAB-H2O2氧化反應(yīng)的催化行為,證明MT-CuNCs具有過(guò)氧化物酶活性,能夠催化DAB顯色。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,通過(guò)465 nm處的吸光度值變化可判斷DAB的氧化程度[8]。據(jù)此,本文制備金屬硫蛋白銅納米簇后,研究建立了比色/光度法檢測(cè)尿酸的新方法。

圖2 不同體系的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.2 UV-visible absorption spectrum of the difference system

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 尿酸氧化體系的優(yōu)化 考察了Tris-HCl緩沖溶液的pH和用量對(duì)尿酸氧化體系A(chǔ)值的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Tris-HCl緩沖液的pH值和用量對(duì) 測(cè)定體系ΔA值的影響Fig.3 Effect of pH value and volume of Tris-HCl buffer solution on ΔA value of determination system

由圖3可知,pH=7.0時(shí),體系的ΔA值最大；當(dāng)緩沖液用量為100 μL時(shí),體系的ΔA值最大。因此,選擇加入100 μL pH=7.0的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

尿酸氧化酶的濃度影響H2O2的釋放,從而影響DAB的氧化速率。由圖4可知,當(dāng)尿酸酶用量為70 μL時(shí),H2O2的釋放量達(dá)到最大,故加入70 μL 200 μg/mL尿酸酶催化尿酸氧化。

圖4 尿酸酶用量的影響Fig.4 Effect of the concentration of uricase

進(jìn)一步考察尿酸氧化的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 尿酸氧化反應(yīng)溫度(A)及反應(yīng)時(shí)間(B)的影響Fig.5 Effect of reaction temperature (A) and reaction time (B)on uric acid oxidation reaction

由圖5A可知,反應(yīng)溫度在20～37 ℃時(shí),隨著溫度的升高,體系吸光度變化值也隨之增大；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到37 ℃后,溫度過(guò)高,尿酸氧化酶的催化活性被破壞,體系的ΔA值逐漸降低,選取37 ℃作為尿酸氧化的反應(yīng)溫度。尿酸酶催化尿酸氧化生成H2O2需要一定的反應(yīng)時(shí)間,由圖5B可知,尿酸孵育30 min時(shí)ΔA最大,這說(shuō)明尿酸酶催化尿酸氧化生成產(chǎn)生H2O2在30 min時(shí)基本反應(yīng)完全。

2.2.2 MT-CuNCs催化DAB顯色體系的優(yōu)化 考察了PBS、Tris-HAc、NaAc-HAc等緩沖溶液對(duì) MT-CuNCs催化DAB顯色體系的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 緩沖體系類(lèi)型的影響Fig.6 Effect of buffer system type

由圖6可知,在NaAc-HAc緩沖溶液中,體系的ΔA值最大,故選擇NaAc-HAc緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)緩沖溶液的pH值和用量進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 NaAc-HAc緩沖液的pH和用量的影響Fig.7 Effect of the pH and volume of NaAc-HAc buffer solution

由圖7A可知,pH=5.0時(shí),體系的ΔA值最大；在pH值過(guò)高下,H2O2不穩(wěn)定,會(huì)分解成H2O和O2,導(dǎo)致氧化DAB的能力下降；pH值過(guò)低時(shí),DAB的顯色反應(yīng)可能被抑制。由圖7B可知,當(dāng)緩沖液的用量為100 μL時(shí),體系的ΔA值最大。因此,選取100 μL pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

在MT-CuNCs催化DAB顯色反應(yīng)體系中,銅納米簇是發(fā)揮HRP催化功能的物質(zhì),其用量對(duì)反應(yīng)體系吸光能力的影響至關(guān)重要。由圖8可知,當(dāng)納米簇的用量在10 ～ 40 μL時(shí),體系ΔA值隨納米簇的用量增加而升高；當(dāng)納米簇的用量超過(guò)40 μL后,體系吸光度ΔA值隨其用量增加反而降低,因此,選擇40 μL作為本實(shí)驗(yàn)中納米簇的用量。

圖8 MT-CuNCs用量的影響Fig.8 Effect of the concentration of MT-CuNCs

對(duì)DAB的用量進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 DAB用量的影響Fig.9 Effect of the concentration of DAB

由圖9可知,當(dāng)DAB的用量在20～40 μL時(shí),體系ΔA值隨DAB的用量增加而升高,但超過(guò)40 μL后,體系ΔA值隨DAB的用量增加反而降低。這可能是因?yàn)镈AB氧化速率依賴(lài)于DAB濃度,即顯示在低DAB濃度下隨著DAB增加氧化速率增加,并且在DAB濃度較高時(shí)顯著抑制速率。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,DAB濃度較高時(shí)聚合物生成速率增加,將會(huì)捕獲體系內(nèi)的活性催化位點(diǎn),這阻礙了空間內(nèi)H2O2或DAB單體的輸送[9]。不僅如此,當(dāng)DAB濃度太高時(shí),體系內(nèi)形成不溶的淺棕色沉淀,影響測(cè)定。因此,選擇40 μL作為本實(shí)驗(yàn)中DAB的用量。

在上述實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對(duì)DAB顯色體系的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖10。

由圖10A可知,20～35 ℃時(shí),隨著反應(yīng)溫度的升高,體系ΔA值隨之升高；但反應(yīng)溫度超過(guò) 37 ℃之后,隨著溫度的升高,體系的ΔA值反而下降。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí),DAB的顯色反應(yīng)緩慢進(jìn)行,而溫度過(guò)高時(shí),H2O2自分解。由圖10B可知,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min時(shí),體系的ΔA值達(dá)到最大,DAB氧化反應(yīng)基本完成。因此,實(shí)驗(yàn)選擇在37 ℃下反應(yīng)30 min后測(cè)定。

圖10 DAB顯色反應(yīng)溫度(A)和時(shí)間(B)的影響Fig.10 Effect of (A) temperature and (B) time of DAB color reaction

2.3 共存物質(zhì)影響

選擇性對(duì)傳感器來(lái)說(shuō)至關(guān)重要,在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,考察葡萄糖(Glu)、甘氨酸(Gly)、賴(lài)氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)以及血清中常見(jiàn)的離子(Na+、K+、Mg2+、Zn2+)對(duì)尿酸傳感器的影響,結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 干擾物質(zhì)的影響Fig.11 Effect of interference substance

由圖11可知,當(dāng)相對(duì)誤差控制在±10%時(shí),50倍的Glu、Na+、K+,25倍的Mg2+、Gly、Lys、Zn2+、Pro不干擾測(cè)定,這表明建立的方法具有良好的抗干擾性。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在優(yōu)化的條件下,考察了ΔA值與尿酸濃度之間的關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)圖12。

由圖12可知,當(dāng)尿酸的濃度在25～750 μmol/L時(shí),ΔA值與尿酸濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為ΔA= 0.31CUA(mmol/L)+0.01,相關(guān)系數(shù)r=0.998。平行測(cè)定空白溶液11次,依據(jù)LOD=3sb/k(sb為空白溶液測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算,檢出限為7.72 μmol/L。對(duì)75,375,625 μmol/L的尿酸溶液分別進(jìn)行11次平行測(cè)定,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.62%,3.02%,3.53%。

圖12 ΔA值與尿酸濃度的關(guān)系Fig.12 Relationship between ΔA value and uric acid concentration and corresponding coloriogram

2.5 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收率

通過(guò)靜脈穿刺獲得3份志愿者的血液樣品。先將15%三氯乙酸與血液樣品按3∶1的比例充分混合15 min后,將混合物以10 000 r/min離心10 min[10]。準(zhǔn)確吸取40 μL上清液,按照所建立的方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 人血清樣本中尿酸的檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 1 Detection of uric acid in human serum samples (n=6)

由表1可知,該方法簡(jiǎn)單易行,準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本研究成功建立了尿酸生物傳感檢測(cè)新方法。MT-CuNCs具有過(guò)氧化物酶活性,對(duì)DAB-H2O2氧化反應(yīng)具有催化行為,能夠催化DAB溶液顯色。尿酸檢測(cè)濃度范圍為25～750 μmol/L,檢出限7.72 μmol/L,可以滿(mǎn)足實(shí)際血液樣品中尿酸的測(cè)定分析。本方法既可以通過(guò)裸眼比色法半定量血樣中尿酸濃度,也可以通過(guò)分光光度法準(zhǔn)確測(cè)定其含量,簡(jiǎn)便易行,抗干擾性良好。