魏云韜

（華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430074）

前言

小麥作為世界三大糧食作物之一，世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)科研工作者都將提高其產(chǎn)量作為研究的重點(diǎn)。目前，功能基因組學(xué)已經(jīng)成為了生命科學(xué)中一個(gè)非常重要的發(fā)展方向，并且也是各國(guó)爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn)方向。隨著人類基因組和模型動(dòng)植物基因組測(cè)序的相繼完成，生命科學(xué)進(jìn)入了以功能基因組學(xué)為核心的后測(cè)序時(shí)代。各種后測(cè)序基因組項(xiàng)目在世界各地引起了極大的關(guān)注。但與此相對(duì)，我國(guó)在復(fù)雜多倍體基因組及其功能基因組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展還比較落后，我國(guó)還在逐漸追趕他們的步伐。利用從模式植物中獲得的研究經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合小麥基因組的特點(diǎn)，利用好多倍體小麥參考基因組的出現(xiàn)這一重大突破，來(lái)加速研究小麥的功能基因組，是小麥研究者的共同任務(wù)。

平常種植的普通小麥都是異源六倍體（AABBDD），其中A、B、D三個(gè)染色體組之間具有一定的同源轉(zhuǎn)化關(guān)系，每個(gè)染色體組含有7條染色體。由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，遺傳轉(zhuǎn)化較為困難。因此本課題將克隆到的基因采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的成熟胚轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步對(duì)其基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

利用六倍體小麥中國(guó)春（TriticumaestivumL.CV.Chinese spring）作為材料，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，擴(kuò)增SPL家族基因。實(shí)驗(yàn)室的前期工作已經(jīng)完成了測(cè)序并且把DNA序列與水稻、擬南芥中的SPLs家族基因進(jìn)行比對(duì)，命名為T(mén)aspL11和TaspL16。再將目的基因?qū)氲揭吧局羞M(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)最終得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的水稻植株。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 春小麥SPLs基因家族的克隆

分別對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同部位的中國(guó)春小麥進(jìn)行取樣，包括：在25℃培養(yǎng)兩周的幼苗的幼根、幼葉和幼莖，成熟期中國(guó)春小麥的雌蕊、雄蕊、節(jié)和節(jié)間，提取混合樣品RNA。將所提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，所有操作步驟均在冰上進(jìn)行，使用TAKARA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)步驟如下：按照表1配置gDNA去除體系，將反應(yīng)體系用移液器輕輕吹打混勻，42攝氏度靜置2 min，再放到冰上。按照表2配置反轉(zhuǎn)錄體系，將上一步得到的液體加入反應(yīng)體系中，用移液器輕輕吹打混勻，在37 ℃靜置15 min，85℃ 反應(yīng)5s，即得到cDNA產(chǎn)物。

表1 gDNA去除體系

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

使用引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)中國(guó)春小麥中的SPLs家族成員設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增的特異性引物，通過(guò)35個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，把清晰明亮的條帶用手術(shù)刀切下裝入1.5mL離心管中，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA片段，按照配制構(gòu)建T載體的反應(yīng)體系，將配制好的體系輕輕混勻并簡(jiǎn)短離心，放到PCR儀中，設(shè)置溫度為16℃，反應(yīng)過(guò)夜。待PCR反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)含有正確目的條帶的單克隆菌液保種，并取出部分菌液送去測(cè)序。再取20 μL菌液加入到25 mL含有50 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基混合，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，使用天根公司質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，從春小麥中提取到的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下圖1所示；使用RT-PCR的方法擴(kuò)增內(nèi)參基因Taactin，以檢測(cè)cDNA，檢測(cè)結(jié)果如下圖2所示：用菌液PCR的方法進(jìn)行陽(yáng)性菌株的鑒定，取少量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)可以找出可能為陽(yáng)性的菌株，構(gòu)建表達(dá)載體即pCAMBIA1304載體后的菌液PCR檢測(cè)如下圖3所示。進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，得到足夠含量的目的基因，對(duì)目的基因進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，同比例增大PCR反應(yīng)體系。用菌液PCR的方法進(jìn)行陽(yáng)性菌株的鑒定，取少量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)可以找出可能為陽(yáng)性的菌株。用兩個(gè)目的基因構(gòu)建相應(yīng)的pCAMBIA1304表達(dá)載體，完成根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化后，得到的含有目的基因的根癌農(nóng)桿菌菌株保存在-80℃冰箱中供水稻的遺傳轉(zhuǎn)化使用。

圖1 中國(guó)春小麥總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 PCR擴(kuò)增小麥actin的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 構(gòu)建pCAMBIA1304表達(dá)載體后的菌液PCR檢測(cè)

1.2 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

將水稻種子去殼，先用75%酒精清洗1 min，再用0.1%HgCl2滅菌15～20 min，然后用無(wú)菌水洗4次。將水稻種子轉(zhuǎn)移墊有多張濾紙的已滅菌平皿中，用濾紙將水稻種子表面的水分吸干。再將水稻種子接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（N6D2）中，每個(gè)培養(yǎng)皿接10顆左右水稻種子，30℃培養(yǎng)40天誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)期間如果檢查發(fā)現(xiàn)有染菌情況，將未染菌的水稻種子接出至新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

從誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中挑選活力強(qiáng)的愈傷組織，具體特征為淡黃色、顆粒狀和干燥。將活力強(qiáng)的愈傷組織上附著的胚乳、芽等其他組織去除干凈，然后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)20天。從繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑選活力強(qiáng)的轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種70粒左右綠豆大小的愈傷組織顆粒，30℃培養(yǎng) 3 d。準(zhǔn)備一支無(wú)菌的 2 mL 離心管，加入 1 mL YEB ks+和50 μL甘油菌，并且將-80℃冰箱中保存的含目的基因的根癌農(nóng)桿菌菌株加入其中，然后放置于28℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)；次日，將菌液稀釋至10-8后涂布到Y(jié)EB ks+固體培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；將干燥的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，用封口膜封口，放置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3天。經(jīng)過(guò)水洗和第一次、第二次篩選，挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織塊，特征為淡黃色、致密、干燥。每個(gè)分化培養(yǎng)基中均勻放置3～4個(gè)愈傷組織塊。光培養(yǎng)（28℃、光照 14 h/黑暗10 h）30～ 40天，在光培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)清理染菌的材料，將未染菌的材料轉(zhuǎn)移至干凈的分化培養(yǎng)基中。等到幼苗高度達(dá)到3～5 cm后進(jìn)行生根培養(yǎng)。用鑷子將幼苗上死掉和發(fā)黃的葉子以及在分化培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的根清理干凈，把幼苗接入生根培養(yǎng)基中。光培養(yǎng)箱生根培養(yǎng)15～20 d，等到根生長(zhǎng)充分后進(jìn)行移栽。將生根充分的幼苗從玻璃杯里取出來(lái)，把根上附著的培養(yǎng)基洗干凈，移栽到裝有土的盆中，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖4所示。

圖4 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

水稻基因組DNA提取采用的是CTAB法。CTAB法即十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，能與核酸形成CTAB-核酸復(fù)合物。氯仿等有機(jī)試劑則作為蛋白質(zhì)變性劑使用，除去與DNA結(jié)合的組蛋白與非組蛋白。RNA酶則可以用于除去多余的RNA成分。最后再用無(wú)水乙醇使CTAB-核酸復(fù)合物沉淀，再使用75%洗滌復(fù)合物除去CTAB，最終得到提取的目的DNA，水稻基因組DNA的提取和PCR檢測(cè)結(jié)果如下圖5所示，采用TaspL11和TaspL16的引物對(duì)T0代再生植株進(jìn)行PCR鑒定，將T0代PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株取葉片蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，采用目的蛋白的多克隆抗體來(lái)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，測(cè)定外源蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如下圖6所示。

圖5 水稻基因組DNA檢測(cè)

圖6 目的蛋白的Western blotting結(jié)果

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

實(shí)驗(yàn)根據(jù)目的基因所在質(zhì)粒上的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用這對(duì)引物去擴(kuò)增兩個(gè)目的基因，分別得到了383bp和673bp的兩條擴(kuò)增片段，通過(guò)檢測(cè)水稻基因組中是否含有上述目標(biāo)片段來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，最終在T0代PCR檢查中共得到14株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

考慮到PCR存在假陽(yáng)性的問(wèn)題，例如轉(zhuǎn)入了目的基因但不表達(dá)的情況，因此在蛋白質(zhì)水平上采用了SDS-PAGE和Western blotting技術(shù)來(lái)驗(yàn)證PCR陽(yáng)性的植株樣片中目的蛋白的表達(dá)情況，以此來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因結(jié)果的可靠性。在對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的葉片蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)中，采用Actin蛋白和Myc標(biāo)簽的蛋白多克隆抗體來(lái)共同檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，以消除內(nèi)參蛋白的影響，確定外源目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，目的蛋白在轉(zhuǎn)基因后代的葉片中大都穩(wěn)定表達(dá)出來(lái)，其蛋白大小在60kD左右。在T0代中獲得了4株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，2株為SPL11基因轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，2株為SPL16基因轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。

對(duì)中國(guó)春小麥中的SPLs基因家族的一些基因轉(zhuǎn)入野生型水稻植株中，并且得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的水稻植株，用于后續(xù)研究小麥SPLs基因的功能。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將從小麥中擴(kuò)增得到的SPL11和SPL16基因轉(zhuǎn)入水稻中，經(jīng)組織培養(yǎng)技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植株。分子水平上使用了PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的整合情況，蛋白質(zhì)水平上使用了SDS-PAGE和Western blotting技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中目的基因的表達(dá)情況，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方法得到了小麥的cDNA，通過(guò)設(shè)計(jì)好的基因特異性擴(kuò)增引物得到了小麥SPL11和SPL16基因，并且構(gòu)建了pCAMBIA1304表達(dá)載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將SPL11和SPL16基因轉(zhuǎn)化到野生型水稻的種子中，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)后，獲得了水稻轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)PCR鑒定，初步得到14株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；經(jīng)過(guò)Western blotting分析，得到了2株SPL11基因穩(wěn)定整合與成功表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，2株SPL16基因穩(wěn)定整合與成功表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。為深入研究小麥SPLs家族基因的結(jié)構(gòu)和功能，尤其是對(duì)研究SPL11和SPL16基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。