肖中元，周 玲，楊紅濤，陳真文，馬 迪

(太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 400038)

異煙肼，又名雷米封(isoniazid；INH；isonicotinyl hydrazine)；化學(xué)名稱為：4-吡啶甲酰肼。異煙肼能抑制結(jié)核桿菌的生長，抗菌作用強，在試管中0.025～0.05 mg/L的濃度即可抑菌，較高濃度對繁殖期細(xì)菌有殺菌作用。臨床結(jié)果表明，在各型肺結(jié)核的進(jìn)展期、播散期、吸收好轉(zhuǎn)期中均發(fā)揮了重要作用[1]；異煙肼片為一線抗結(jié)核藥物[2-3]。

查閱文獻(xiàn)，尚無關(guān)于異煙肼片微生物限度檢查的相關(guān)研究報道。現(xiàn)行《中國藥典》藥典也未公布具體品種的檢查方法，僅在通則中收載了平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法三種檢查方法[4]，根據(jù)產(chǎn)品的不同特性，可選擇不同的方法進(jìn)行適用性試驗。異煙肼片對部分微生物有抑制作用，因此本文通過薄膜過濾法去除異煙肼對微生物的影響，并對微生物限度檢方法查進(jìn)行了驗證，試驗結(jié)果表明，本方法能有效檢測異煙肼片含有微生物的程度。

1 儀器與試液

1.1 儀器

電子天平(龍騰電子 JD500-3型)，pH計(梅特勒托利多S210型)，凈化工作臺(蘇凈安泰 VS-1300L-U 型)，LMQ.C型立式滅菌鍋(新華牌 LMQ.C型)，生化培養(yǎng)箱(永生儀器 YSEI SHH-250L型)，數(shù)顯恒溫振蕩器(上海梅香 SHY-2A型)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(永生儀器 YSEI CS101-2ABN型)，微生物限度檢查儀(杭州盈天 YT-X303型)。

1.2 樣品

異煙肼片(西南藥業(yè)股份有限公司，批號151101、160101、160102) 。

1.3 試驗菌種

黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]，以上試驗菌株均自中國食品藥品檢定研究院采購。

1.4 對照培養(yǎng)基

胰酪大豆液體對照培養(yǎng)基(批號135026-201401)、胰酪大豆瓊脂對照培養(yǎng)基(批號135025-201603)、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基(批號135013-201502)、沙氏葡萄糖液體對照培養(yǎng)基(135008-201503)、麥康凱液體對照培養(yǎng)基(批號135030-201602)、麥康凱瓊脂對照培養(yǎng)基(135009-201503)均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.5 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基均是購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司的脫水干粉培養(yǎng)基，臨用時按其標(biāo)簽說明配制；胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基(批號20151216)、胰酪大豆液體培養(yǎng)基(批號20151202)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號20160102 )、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號20151028)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號20170112)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號201605222)。

1.6 試液

稀釋劑Ⅰ：0.9% 無菌氯化鈉溶液；稀釋劑Ⅱ：含0.05%聚山梨酯80的0.9% 無菌氯化鈉溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液制備

分別將銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中，置于33℃恒溫振蕩器培養(yǎng)24 h后取出計數(shù)，并用稀釋劑Ⅰ稀釋成1000 cfu/mL的菌懸液，置于2～8℃?zhèn)溆?。將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)中，置于25℃恒溫振蕩器培養(yǎng)48 h后取出計數(shù)，并用稀釋劑Ⅰ稀釋成1000 cfu/mL的菌懸液，置于2～8℃?zhèn)溆?。將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)斜面上，置于25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天后取出計數(shù)，加入3 mL稀釋劑Ⅱ?qū)㈡咦酉疵?，并用稀釋劑Ⅱ稀釋?000 cfu/mL的孢子懸液，置于2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試液的制備

取供試品2瓶混合，稱取10 g至無菌的錐形瓶中，加入稀釋劑Ⅰ至100 mL，振搖，使溶解，作為1∶10的供試液，備用。

2.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查

取新鮮制備的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌懸液0.1 mL，分別接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)及其對照培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，置于33℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。另將上述三種菌懸液分別接種至TSB培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基中，平行制備2管，置33℃恒溫振蕩器培養(yǎng)3天。

取新鮮制備的白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 mL，分別接種至TSA培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，置于33℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天。另將上述二種菌懸液分別接種至SDA培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，平行制備2個平皿，置于25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天。

各被檢液體培養(yǎng)基管與相對應(yīng)的對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌生長良好；各被檢固體培養(yǎng)基與相對應(yīng)的對照培養(yǎng)基管比較，菌落形態(tài)、大小均一致，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基菌落平均數(shù)比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)。結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基適用性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明：微生物計數(shù)用培養(yǎng)基適用性符合檢查要求。

2.4 控制菌(大腸埃希菌)培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.1 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查

取大腸埃希菌懸液0.1 mL，無菌操作接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，置于42℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h。結(jié)果表明，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比試驗菌生長良好。

2.4.2 固體培養(yǎng)基促生長能力與指示特性檢查

取大腸埃希菌懸液0.1 mL，無菌操作用涂布法分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，置于33℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18 h。結(jié)果表明，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征一致。

2.4.3 培養(yǎng)基抑制能力檢查

取金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，無菌操作接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，置于33℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48 h，無試驗菌生長。

上述試驗結(jié)果表明，控制菌(大腸埃希菌)培養(yǎng)基適用性檢查符合要求。

2.5 計數(shù)方法適應(yīng)性試驗

根據(jù)中國藥典通則配置試驗組、供試品對照組、菌液組樣品，進(jìn)行適用性試驗。

2.5.1 需氧菌總數(shù)

①試驗組: 分別取供試液10 mL分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 mL，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

②供試品對照組: 取供試液10 mL加入0.1 mL稀釋液Ⅰ代替菌液，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

③菌液組: 取稀釋液Ⅰ10 mL分別加入與試驗組相同的菌懸液0.1 mL，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

通過無菌操作將試驗組、供試品對照組、菌液組的濾膜取出，菌面朝上分別貼于TSA培養(yǎng)基上，置于33℃恒溫培養(yǎng)72 h，計數(shù)。

進(jìn)行3 次獨立的平行試驗，計算回收率，應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。

回收率=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/ 菌液對照組菌落數(shù)

表2 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適應(yīng)性結(jié)果

2.5.2 霉菌和酵母菌總數(shù)

①試驗組: 取供試液10 mL分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 mL，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

②供試品對照組: 取供試液10 mL加入0.1 mL稀釋液Ⅰ，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

③菌液組: 取稀釋液Ⅰ10 mL分別加入被檢菌懸液0.1 mL，混勻。置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋液Ⅰ沖洗，每膜沖洗2次。

通過無菌操作將試驗組、供試品對照組、菌液組的濾膜取出，菌面朝上分別貼于SDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)120 h，計數(shù)。

進(jìn)行3 次獨立的平行試驗，計算回收率，應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，結(jié)果見表3。

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)回收率結(jié)果

適用性試驗結(jié)果表明，供試液制備方法及薄膜過濾法計數(shù)方法可以用于該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

2.6 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗

根據(jù)中國藥典通則配置供試品組、陽性對照組、陰性對照組樣品，進(jìn)行適用性試驗。

①供試品組：取1∶10的供試液10 mL置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋劑Ⅰ洗滌，抽干，取出濾膜置于

100 mLTSB培養(yǎng)基中，于33℃培養(yǎng)18 h。

②陽性對照組：取1∶10的供試液10 mL置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋劑Ⅰ洗滌，抽干，再加0.1 mL大腸埃希菌懸液，抽干，取出濾膜置于100 mL TSB培養(yǎng)基中，于33℃培養(yǎng)18 h。

③陰性對照組：取稀釋劑Ⅰ10 mL置于微生物限度檢查儀過濾，用100 mL稀釋劑Ⅰ洗滌，抽干，取出濾膜置于100 mL TSB培養(yǎng)基中，于33℃培養(yǎng)18 h。

分別取供試品組、陽性對照組、陰性對照組的TSB培養(yǎng)物1 mL接種于100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，于42℃增菌培養(yǎng)24 h；取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

陽性對照檢出試驗菌(大腸埃希菌)，陰性對照和供試品組無菌生長。結(jié)果見表4。

表4 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法適用性結(jié)果

試驗結(jié)果表明，供試液制備方法及控制菌檢查方法可以用于異煙肼片的大腸埃希菌檢查。

2.7 樣品測定

取三批供試品檢查樣品的微生物限度，三批樣品均符合非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)控制菌、需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的要求。

3 討論

微生物限度檢查容易受環(huán)境中微生物的污染，導(dǎo)致樣品檢測出現(xiàn)誤差。因此，對微生物實驗室環(huán)境的控制至關(guān)重要，并需要對實驗室進(jìn)行日常環(huán)境監(jiān)測。實驗操作也必須嚴(yán)格遵循無菌操作的原則。

培養(yǎng)基是微生物的生長基礎(chǔ)，因此，培養(yǎng)基要具有良好的質(zhì)量，其貯藏條件以及制備均需嚴(yán)格控制。

本文按照《中國藥典》口服固體制劑通則的要求，建立了異煙肼片的微生物限度檢查方法。當(dāng)采用平皿計數(shù)法測定供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)時，僅金黃色葡萄球菌回收率在0.5～2.0范圍內(nèi)，其余各菌回收率均不超過0.4，表明異煙肼片供試液制備方法存在一定的抑菌活性作用。因此，采用薄膜過濾法消除供試品的影響，從而準(zhǔn)確測定供試品的控制菌、需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)。