吳文惠，王少卿

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.煙臺(tái)萬(wàn)潤(rùn)藥業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006)

維格列汀(vildagliptin)，化學(xué)名：1-[(3-羥基-金剛烷基-1-氨基)乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈[1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)acetyl]-pyrrolidine-2(S)-carbonitrile]，是諾華公司開(kāi)發(fā)的二肽基酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)抑制劑[1]，用于2型糖尿病的治療，具有選擇性高、競(jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)、可逆性高的特點(diǎn)[2]。維格列汀合成中間體(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲酰胺(VGN-A)和(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲腈(VGN-B)具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)[3]。本文首次建立了測(cè)定維格列汀中潛在基因毒性雜質(zhì)的有效方法。基因毒性雜質(zhì)可根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)來(lái)設(shè)定限度[4]。TTC值是每人每天攝入限量1.5μg[5]。維格列汀的最大日劑量為100 mg，根據(jù)TTC 值限定其基因毒性雜質(zhì)的含量不得超過(guò)0.0015%。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)、維格列汀原料藥(煙臺(tái)萬(wàn)潤(rùn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：VPVGN14001、VPVGN14002)；維格列汀對(duì)照品(KQRG1707191批，99.7%)；VGN-A對(duì)照品(KQLei1706242-2批，99.48%)；VGN-B對(duì)照品(KQLei1706241-2批，99.85%)；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉2.1 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.1)；流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫(程序見(jiàn)表1)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的配制

精密稱取維格列汀原料藥約200 mg，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得20 mg·mL-1供試品溶液。精密稱取維格列汀對(duì)照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1維格列汀對(duì)照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得維格列汀對(duì)照品溶液。精密稱取VGN-A對(duì)照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-A對(duì)照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得VGN-A對(duì)照品溶液。精密稱取VGN-B對(duì)照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-B對(duì)照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得VGN-B對(duì)照品溶液。精密量取維格列汀對(duì)照品儲(chǔ)備液、VGN-A對(duì)照品儲(chǔ)備液和VGN-B對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得約含維格列汀、VGN-A、VGN-B各3 μg·mL-1的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取空白溶劑流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)、維格列汀對(duì)照品溶液、VGN-A溶液、VGN-B溶液、系統(tǒng)適用性溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下測(cè)定，維格列汀、VGN-A、VGN-B的定位圖譜見(jiàn)圖1～3。結(jié)果顯示：溶劑峰不干擾測(cè)定(見(jiàn)圖4)，維格列汀峰與VGN-A峰和VGN-B峰的分離度均大于3.0(見(jiàn)表2，圖5) ，專屬性好。

表2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中各色譜峰的保留時(shí)間和分離度

圖1 VGN-A

圖3 維格列汀

圖4 溶劑

圖5 系統(tǒng)適用性溶液

2.4 重復(fù)性、中間精密度與溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取VPVGN14001批供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。未檢出VGN-A，計(jì)算得VGN-B的RSD=5.75%，表明方法的重復(fù)性好；同法配制供試品溶液，兩名分析人員平行測(cè)定6次，未檢出VGN-A，計(jì)算得VGN-B的RSD=9.44%，表明方法的精密度符合要求。取VPVGN14002批供試品溶液，分別在0、140、280、420、560、700、840 min進(jìn)樣20 μL，VGN-A和VGN-B均未檢出，維格列汀峰面積的RSD=0.87%，表明供試品溶液室溫放置14 h穩(wěn)定。

2.5 耐用性實(shí)驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，改變柱溫(25℃、35℃)、流速(0.8 mL· min-1、1.2 mL· min-1)、流動(dòng)相A的pH值(1.9、2.3)以及兩種不同品牌C18色譜柱，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)的考察，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示：當(dāng)改變以上系統(tǒng)條件時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中維格列汀峰與VGN-A峰和VGN-B峰的分離度均大于3.0，符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求。

表3 不同色譜條件下系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中各色譜峰的保留時(shí)間和分離度

2.6 檢測(cè)限和定量限

取“2.2”項(xiàng)的VGN-A對(duì)照品貯備液、VGN-B對(duì)照品貯備液，加流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，根據(jù) 3 倍噪音計(jì)算系統(tǒng)對(duì)樣品的檢測(cè)限、10 倍噪音計(jì)算系統(tǒng)對(duì)樣品的定量限。VGN-A、VGN-B的檢測(cè)限溶液的質(zhì)量濃度分別為0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，檢測(cè)限分別為0.091 ng、0.095 ng；定量限溶液的質(zhì)量濃度分別為0.01511 μg·mL-1、0.01429 μg·mL-1，定量限分別為0.030 ng、0.029 ng。

2.7 線性和范圍

精密量取“2.2”項(xiàng)的VGN-A貯備液、VGN-B貯備液，分別用流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)逐級(jí)稀釋，配置成一系列質(zhì)量濃度的線性溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以峰面積Y對(duì)樣品質(zhì)量濃度X作線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明VGN-A、VGN-B的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表4 線性范圍考察結(jié)果

2.8 加樣回收率

精密稱取供試品9份，每份約200 mg，置10 mL量瓶中，每組3份分別平行加入高、中、低三種體積的VGN-A對(duì)照品貯備液、VGN-B對(duì)照品貯備液，用流動(dòng)相A-乙腈(80∶20)定容，分別進(jìn)樣，按外標(biāo)法以維格列汀峰面積計(jì)算VGN-A、VGN-B的含量和回收率。VGN-A、VGN-B的平均回收率分別為99.0%、93.2%，RSD分別為4.7%、5.4%，符合定量分析的要求。

3 討論

藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)靈敏度和選擇性要求高，常規(guī)的HPLC或GC方法一般達(dá)不到檢測(cè)藥物中痕量基因毒性雜質(zhì)的靈敏度要求，多選用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)或氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行測(cè)定[3]。本文采用常規(guī)的HPLC法，在相關(guān)參考文獻(xiàn)[6]基礎(chǔ)上優(yōu)化了梯度洗脫的程序，VGN-A、VGN-B的檢測(cè)限分別為0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，定量限分別為0.01511、0.01429 μg·mL-1，靈敏度顯著提高，兩個(gè)雜質(zhì)的定量限和檢測(cè)限均顯著低于雜質(zhì)限度(0.3 μg·mL-1)，能滿足基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)要求。該方法下兩雜質(zhì)與主峰的分離度均大于3.0，確保了該方法的專屬性。本實(shí)驗(yàn)從專屬性和系統(tǒng)適用性、溶液穩(wěn)定性、耐用性、加樣回收率、線性和范圍、重復(fù)性與中間精密度、檢測(cè)限和定量限等方面進(jìn)行了分析方法驗(yàn)證，為檢測(cè)兩種潛在基因毒性雜質(zhì)VGN-A和VGN-B的含量提供了可靠性依據(jù)，且該方法操作簡(jiǎn)單，不需聯(lián)用質(zhì)譜即可對(duì)基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行高靈敏度的可靠測(cè)定。