高 靜，邊步榮，高彥東，薛榮亮

1.延安大學(xué)第二附屬醫(yī)院(陜西省榆林市第一醫(yī)院)麻醉科(榆林 719000)；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科(西安 710004)

氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的兩種主要機(jī)制[1]。血紅素加氧酶-1(Heme oxygennase-1，HO-1)具有潛在的細(xì)胞保護(hù)作用，也是目前發(fā)現(xiàn)最易受誘導(dǎo)的酶，能被各種引起氧化應(yīng)激的因素所誘導(dǎo)而增加表達(dá)，其代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)大的抗氧化能力[2-3]。而細(xì)胞凋亡具有主動(dòng)性、選擇性、可逆性，大多發(fā)生在細(xì)胞壞死之后，如能采取恰當(dāng)?shù)奶幚泶胧行б种坪湍孓D(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，將有利于腦再灌注損傷的治療，改善神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)歸[4-5]。茶氨酸屬于保健食材，本課題組前期的研究已證明其通過(guò)抗氧化作用、降低神經(jīng)元的氧化水平對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)擬探討茶氨酸腦保護(hù)作用的機(jī)制是通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)來(lái)進(jìn)行，還是通過(guò)自身減少氧化應(yīng)激損傷和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)，報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 健康清潔雄性SD大鼠270只，體重180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。L-茶氨酸(美國(guó)genview公司)，HO-1單克隆抗體(StressGen)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物試劑公司)，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)SIGMA公司)，HO-1引物(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司)，GAPDH引物(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，PCR合成儀(美國(guó)ABI公司)，多重實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(德國(guó)伯樂(lè)公司)，GAPDH基因序列181 (cattgacctcaactacatggtctacatgttccagtatgactctacccacggcaagttcaa)，241(cggcacagtcaaggctgagaatgggaagctggtcatcaacgggaaacccatcaccatctt)，301(ccaggagcgagatcccgctaacatcaaatggggtgatgctggtgctgagtatgtcgtgga)，121(ggttaccagggctgccttctcttgtgacaaagtggacattgttgccatcaacgacccctt)，HO-1基因序列1021(tctcatgtagccttctctctgcaggggagaatcttgcctggctctcttttcttgggcctc)，1081(taagaaagcttttggggttcctcgcccccttcctgtgtcttcctttgtctctctggaatg)，1141(gaaggagatgcctggcacatttccctcaccaaaagcacagccaggggcctgaacttggaa)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為三組：假手術(shù)組(PO組)，腦缺血再灌注組(IR組)，茶氨酸組(TH組)。采用四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，茶氨酸干預(yù)組于全腦缺血模型建立后3 min經(jīng)尾靜脈注射25%茶氨酸溶液4 ml/kg(即1000 mg/kg)，其余兩組分別尾靜脈注射生理鹽水4 ml/kg。大鼠分別于再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h處死取腦組織，HE染色觀察海馬結(jié)構(gòu)形態(tài)變化；IHC免疫組化染色(一抗為小鼠IgG，濃度為1∶50)和實(shí)時(shí)定量PCR觀察HO-1蛋白在海馬各個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)變化；TUNNEL染色和流式細(xì)胞儀觀察海馬各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況。

結(jié) 果

1 HE染色海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)改變 光鏡下可見PO組各時(shí)點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞3～4層排列整齊而緊密，胞質(zhì)淡紅色，胞核藍(lán)色(圖1)；IR組48 h，海馬椎體細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，排列紊亂，細(xì)胞皺縮，數(shù)量減少(圖2)；TH組在組織形態(tài)學(xué)上較IR組有改善，細(xì)胞數(shù)量也較IR組增加(圖3)。

2 免疫組化染色(IHC) PO組各時(shí)點(diǎn)海馬組織幾乎無(wú)棕黃色淡染的HO-1陽(yáng)性細(xì)胞，齒狀回可見少量HO-1陽(yáng)性的棕黃淡染細(xì)胞(圖4)。IR組24 h海馬HO-1陽(yáng)性細(xì)胞增加，海馬齒狀回細(xì)胞幾乎均被棕染(圖5)，HO-1蛋白大量表達(dá)。TH組與IR組比較24 h明顯可見棕黃淡染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(圖6)。

3 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè) PO組各時(shí)點(diǎn)海馬組織幾乎無(wú)棕色淡染的凋亡細(xì)胞(圖7)；IR組48 h齒狀回棕色淡染的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞遍布整個(gè)視野(圖8)；TH組48 h齒狀回棕黃淡染的凋亡細(xì)胞明顯減少(圖9)。

4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 結(jié)果顯示PO組凋亡率較低(圖10)，IR組凋亡率在缺血再灌注6 h后明顯上升(P<0.05)，在再灌注48h后到達(dá)頂峰(圖11)。TH組凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)均低于IR組(P<0.05)，見表1。

表1大鼠全腦缺血再灌注后個(gè)時(shí)點(diǎn)海馬凋亡率比較(%)

組 別n2 h6 h12 h24 h48 hPO組614.73±1.3015.07±1.3815.37±0.6515.48±0.4115.58±0.32IR組619.83±0.52?21.32±0.83?24.58±0.86?25.31±0.63?27.79±1.18?TH組618.29±1.54#20.77±0.84#24.18±0.79#24.8±0.51#27.19±0.73#

注：PO組與IR組相比*P<0.01；IR組與TH組相比,#P<0.01

5 HO-1的時(shí)程表達(dá) PO組HO-1 mRNA表達(dá)量低，IR組HO-1表達(dá)量與PO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，2 h開始升高，持續(xù)到24 h，在48 h時(shí)表達(dá)水平稍有回落， IR組與TH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TH組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)HO-1 相對(duì)表達(dá)量均低于IR組。見表2、3。

表2海馬組織GAPDH、HO-1 real-time PCR CT值

表3海馬組織HO-1相對(duì)表達(dá)量

注：IR組與PO組相比，*P<0.05；TH組與PO組相比，#P<0.05

討 論

腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡均是參與其中的重要病生機(jī)制[7]，盡管已取得了令人振奮的研究進(jìn)展，但再灌注損傷仍然是臨床上棘手的病生現(xiàn)象，是對(duì)臨床醫(yī)生的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

HO-1是血紅素分解代謝的起始酶和限速酶，分解血紅素產(chǎn)生一氧化碳(CO)、鐵離子和膽綠素，在受到氧化應(yīng)激時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，有潛在的細(xì)胞保護(hù)作用。其代謝產(chǎn)物之一膽綠素?fù)碛袕?qiáng)大的抗氧化能力，可以直接清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，阻斷氧化應(yīng)激損傷；代謝產(chǎn)物之二CO，擴(kuò)血管、抑制血小板聚集、增強(qiáng)血流灌注、穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而抑制氧化應(yīng)激損傷；鐵離子調(diào)節(jié)包括HO-1自身在內(nèi)的多種基因表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)研究顯示，HO-1基因敲除的神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激損傷敏感性增加，而HO-1表達(dá)上調(diào)則增加神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。HO-1誘導(dǎo)表達(dá)是神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激損傷做出反應(yīng)過(guò)程的重要事件[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全腦缺血再灌注后，24 hHO-1陽(yáng)性細(xì)胞在海馬結(jié)構(gòu)大量表達(dá)，齒狀回完全黃染，48 h表達(dá)量有所回落。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，PO組HO-1 的表達(dá)較低，IR組HO-1的表達(dá)量從2 h開始升高，持續(xù)到24 h,48 h略有回落。這些結(jié)果均與現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)相一致，進(jìn)一步證實(shí)了腦缺血再灌注對(duì)大腦的應(yīng)激刺激和HO-1的受誘導(dǎo)表達(dá)。

茶氨酸作為一種食品添加劑已廣泛用于點(diǎn)心、糖果、果凍、口香糖等，毒性實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其毒性[10]，既往的研究發(fā)現(xiàn)，茶氨酸具有抑制咖啡堿引起的興奮、舒緩神經(jīng)、降血壓和增強(qiáng)免疫力等多種保健及藥用功能，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，給予缺血再灌注大鼠茶氨酸干預(yù)后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)HO-1陽(yáng)性細(xì)胞在海馬結(jié)構(gòu)表達(dá)減少，海馬組織HO-1 mRNA表達(dá)下降，且均低于IR組，所以推論，在受到腦缺血再灌導(dǎo)致的氧化應(yīng)激刺激后，茶氨酸是通過(guò)其自身的抗氧化應(yīng)激能力，減少缺血再灌注損傷，而非通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其腦保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的一種主要機(jī)制，是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡，具有主動(dòng)性、選擇性和可逆性的。腦缺血再灌注后凋亡的發(fā)生較為滯后[11]，因此，如能采取恰當(dāng)措施有效抑制和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，將有利于腦損傷的改善和治療。在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法(TUNEL)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注發(fā)生后的2 h、6 h、12 h、24 h、48 h，細(xì)胞的凋亡率不斷增加，在48 h達(dá)到了凋亡峰值。且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IR組凋亡率均高于PO組，在腦缺血再灌注后給予茶氨酸注射干預(yù)，TH組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡率均顯著下降。說(shuō)明茶氨酸可以降低海馬組織的細(xì)胞凋亡，對(duì)全腦缺血再灌注損傷有改善作用。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，隨著時(shí)間增加，細(xì)胞凋亡率增加，HO-1表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率與HO-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，所以，生理劑量的HO-1蛋白的抗氧化應(yīng)激能力，并未達(dá)到降低細(xì)胞凋亡的作用。HO-1蛋白與細(xì)胞凋亡之間的劑量關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以探索。

綜上所述，在全腦缺血再灌注后給予茶氨酸干預(yù)，海馬結(jié)構(gòu)組織細(xì)胞學(xué)得到改善，細(xì)胞凋亡減少，但HO-1蛋白表達(dá)降低，由此推論腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，茶氨酸通過(guò)其自身抗氧化應(yīng)激能力發(fā)揮腦保護(hù)作用，而不是通過(guò)上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用，并進(jìn)一步證明茶氨酸可通過(guò)抑制凋亡來(lái)發(fā)揮腦保護(hù)作用。