潘風光 侯力簫 王 瑩 劉靜波

（吉林大學食品科學與工程學院營養(yǎng)與功能食品研究室 長春130062）

我國是肉雞生產(chǎn)大國，據(jù)統(tǒng)計，2014年我國肉雞產(chǎn)量已高達1 380 萬t，占到全球總產(chǎn)量的15%以上[1-2]。在這種大量生產(chǎn)的情況下，產(chǎn)生了大量的以頭、皮、腿、腳、骨頭、內(nèi)臟、羽毛、糞便等形式的固體廢棄物，統(tǒng)稱為雞副產(chǎn)物[3]。雞副產(chǎn)物中含有大量的營養(yǎng)因子，然而目前利用率較低，多數(shù)被棄于環(huán)境中，對雞副產(chǎn)物進行深入研究，制備具有高附加值的產(chǎn)品，不但能夠降低廢棄物不當處理造成的環(huán)境污染，還能提高副產(chǎn)物綜合利用價值，拓展其應用領(lǐng)域[4-5]。

蛋白胨是蛋白質(zhì)經(jīng)水解分離純化后得到的一組混合物，可供作細菌培養(yǎng)基用，提供微生物生長過程中的主要N 源、C 源及生長因子[6]。其產(chǎn)品在醫(yī)藥行業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生物化工等領(lǐng)域均有較大的應用價值[7-8]，同時也是大米、面粉、醬油及各種保健食品中蛋白質(zhì)的添加劑。目前我國關(guān)于蛋白胨產(chǎn)品的研究較少，大部分集中在植物蛋白胨的研究，對動物副產(chǎn)物加工利用領(lǐng)域研究不足，而用雞副產(chǎn)物加工制備蛋白胨的研究更少。大量高營養(yǎng)的雞副產(chǎn)物為蛋白胨的制備提供了豐富的原料來源。

在已有研究的基礎(chǔ)上，采用雙酶水解方法，通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化雞副產(chǎn)物制備蛋白胨工藝，減少試驗次數(shù)[9-10]，旨在提高資源利用率，為微生物生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

脫脂雞副產(chǎn)物（干重比雞骨∶雞內(nèi)臟=3∶1），其中雞內(nèi)臟干重比為雞皮∶雞肝∶雞胗=1∶1∶1，吉林德惠食品有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶，美國Sigma 公司；標準蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酪素，上海永瑞生物科技有限公司；L-酪氨酸，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、碘化鉀、福林酚、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純級。

JJ-1 型精密定時電動攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；STARTEER 300 型奧豪斯pH 計，上海泉佰儀器有限公司；CP124C 型電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；UV-2550 型紫外-可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；DK-8D 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；CR20B2 型高速冷凍離心機，日本Hitachi 公司；DW-86L388A 型超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 電位滴定法測定氨基態(tài)氮 按照GB/T 5009.39-2003 方法，采用電位滴定法測定氨基態(tài)氮。

1.2.2 水解度的測定

1.2.3 蛋白胨含量的測定 采用雙縮脲法。

1.2.3.1 試劑的配制

1） 標準蛋白胨溶液 精確稱取0.5 g 干燥至恒重的細菌學蛋白胨，用30%NaOH 溶液0.5 mL和蒸餾水3 mL 使其充分溶解，加水定容100 mL，即5 mg/mL 的標準蛋白胨溶液[11]。

2）雙縮脲試劑 溶解4.5 g 酒石酸鉀鈉于20 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液中，加0.5 g 硫酸銅（Cu-SO4·5H2O），待溶解后，加入0.5 g 碘化鉀，用0.2 mol/L NaOH 溶液稀釋至100 mL，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 操作步驟

1） 標準曲線的繪制 分別取標準蛋白胨溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 mL 于11 只試管中，蒸餾水補足至3.0 mL，分別加入3.0 mL 自制的雙縮脲試劑后混合均勻。以零管作空白，在540 nm 處比色測定，記錄吸光度。每支試管做平行試驗3 次。

2） 樣品測定 將樣品稀釋至蛋白胨含量約為4～5 mg/mL，取稀釋樣品1 mL，用蒸餾水補足至3.0 mL，加入3.0 mL 雙縮脲試劑，混勻，用蒸餾水作空白，于540 nm 處進行比色測定[12]，記錄吸光度。

注意：1）、2）步驟在30 min 內(nèi)完成，否則會產(chǎn)生霧狀沉淀。

1.2.3.3 計算 由標準曲線得出稀釋后樣品的質(zhì)量濃度為C（mg/mL），原樣品中蛋白胨質(zhì)量濃度為Cpept，則：

Cpept=C×稀釋倍數(shù)

式中：Cpept——水解液中蛋白胨含量，mg/mL；V——水解液體積，mL；M——水解液中原料干物質(zhì)質(zhì)量，g。

1.2.4 蛋白酶活力的測定 采用Folin-酚法。

1.2.4.1 福林試劑稀釋液的制備 將福林試劑與蒸餾水按照1∶2 的比例混合均勻，即福林試劑稀釋液。

1.2.4.2 L-酪氨酸標準曲線的繪制

1） 100 μg/mL L-酪氨酸標準溶液配制方法根據(jù)福林法測酶活，按照文獻[12]的方法配制標準溶液，具體操作見表1。繪制出L-酪氨酸標準曲線，根據(jù)所得線性方程計算吸光度常數(shù)K 值。其中K 值應在95～100 范圍。

1.2.4.3 蛋白酶活力的測定 分別稱取1～2 g 蛋白酶，用少量對應緩沖液溶解后，測定酶活力。按表2操作步驟進行，最后在波長680 nm 處測定吸光度值。

表1 L-酪氨酸標準溶液的配制Table 1 Preparation of L-tyrosine standard solution

表2 酶活力測定加樣順序Table 2 The sample order of enzyme activity determination

1.2.5 雙酶水解制備蛋白胨工藝研究 對雞副產(chǎn)物按照超聲波輔助堿法提取蛋白[13]。稱取定量的蛋白提取物，按照液固比4∶1 加入蒸餾水使其浸泡充分，用pH 計測定pH，加入6 000 U/g 的蛋白酶使其充分酶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液及0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)溶液的pH 值。結(jié)束后將溶液置于90 ℃水浴中滅酶10 min[14]。所得酶解液在4 000 r/min 離心10 min，取上清液測定其水解度及蛋白胨得率。接著，在40 ℃，以30 r/min 的轉(zhuǎn)速將水解上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，之后，將濃縮液真空冷凍干燥，過120 目篩，得到蛋白胨粉末。

1.2.6 二次通用旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化雙酶水解工藝設(shè)計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以蛋白胨得率為響應值，選擇雙酶配比（堿性蛋白酶：胰蛋白酶）（X1）、酶解溫度（X2）、酶解pH（X3）、酶解時間（X4）4 個試驗因素，進行四元（1/2 實施）二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計，試驗方案如表3所示，用DPS 分析軟件優(yōu)化最佳酶解條件。

表3 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計因素水平表Table 3 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力測定結(jié)果

2.1.1 酶活力測定標準曲線 由圖1可知L-酪氨酸標準曲線的回歸方程為y=0.0102x+0.0016，可計算出當OD680值為1 時酪氨酸的量，即吸光度常數(shù)K 值，K=97.88。

本試驗所用蛋白酶實際酶活力計算方法如下：

式中：X——蛋白酶實際酶活力，U/g；A——樣品平行試驗的平均吸光度；K——吸光度常數(shù)；4——反應試劑總體積，mL；n——稀釋倍數(shù)；10——反應時間，min。

2.1.2 兩種蛋白酶實際酶活力 見表4。

2.2 水解液中蛋白胨含量測定標準曲線

以蛋白胨濃度為橫坐標，波長540 nm 處的吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線，如圖2所示。根據(jù)方程得到蛋白胨含量計算公式為：y=0.0569x×0.0034（R2=0.9992）。

2.3 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計分析結(jié)果

2.3.1 數(shù)學模型的建立與顯著性檢驗 雙酶水解制備蛋白胨的四元（1/2 實施）二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，方差分析見表6。

圖1 L-酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of L-tyrosine

表4 兩種蛋白酶的實際酶活力Table 4 Actual enzyme activity of two kinds protease

圖2 蛋白胨溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of peptone solution

表5 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Text scheme and results in quadratic general rotary unitized design

表6 試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of results

根據(jù)試驗結(jié)果得到擬合方程的各項系數(shù)，且蛋白胨得率方程為：

Y=29.2586+1.1782X1+0.8304X2+0.9769X3+0.8305X4-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2-0.4488X1X3+1.9038X1X4。

對該模型進行顯著性分析，結(jié)果如表6所示。該回歸方程的失擬性檢驗F1=2.7020＜F0.05（5，3）=9.01，結(jié)果不顯著，表示未知因素對試驗結(jié)果干擾較??；顯著性檢驗F2=16.3893＞F0.01（11，8）=5.74，結(jié)果極顯著，表示該模型預測值與實測值擬合性良好。單因素中X2和X4不顯著，X1和X3均達到顯著水平，且二次項均極顯著。剔除α=0.10 的不顯著項得到回歸方程：

Y=29.2586+1.1782X1+0.9769X3-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2+1.9038X1X4

最高值的各因素水平組合為：X1=1.682，X2=-1，X3=0，X4=1，即雙酶配比1.84∶1，酶解 溫 度50℃，酶解pH 8.0，酶解時間4 h，此時Ymax=29.86%。

2.3.2 蛋白胨得率單因素效應分析 根據(jù)試驗結(jié)果分析單因素效應（其它因子為零水平），結(jié)果如表7所示。圖3為各單因素與蛋白胨得率之間的關(guān)系圖。

表7 單因素效應分析Table 7 Effect analysis of single factor

由表7和圖3得知，蛋白胨得率隨各因素水平的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且影響順序是X1＞X3＞X4＞X2，即雙酶配比＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。

由表6可看出，交互作用存在且達到顯著水平的因素有X1X2及X1X4，僅對這兩組因素的交互作用進行效應分析。選取2 個因素零水平，考察另外2 個因素的交互作用，得到圖4。由圖4a 可看出在酶解溫度一定時，增大雙酶配比可顯著提高蛋白胨得率，而在雙酶配比一定時，升高溫度使蛋白胨得率呈先上升后平穩(wěn)的趨勢；圖4b 表明雙酶配比和酶解時間的交互作用對蛋白胨得率同樣有較大影響。

2.3.3 酶解工藝優(yōu)化與驗證 根據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)試驗不僅有單因素效應，還有因素間的相互作用，很難僅從這兩項分析中確定最優(yōu)酶解條件，而且四元二次回歸數(shù)學模型無法確定蛋白胨得率的極大值。本試驗綜合采用頻率法分析該回歸模型[15]，確定最佳酶解條件。表8為蛋白胨得率大于23.86%的121 個方案中各變量取值的頻率分布。

圖3 各單因素與蛋白胨得率的關(guān)系Fig.3 Relationship of single factors and yield of peptone

由表8可知，在95%置信區(qū)間內(nèi)蛋白胨得率大于23.86%的各變量取值區(qū)間分別為0.301～0.680，-0.509～-0.157，0.274～0.591，0.084～0.427，即雙酶配比為1.115 ∶1～1.34 ∶1（質(zhì)量比），酶解溫度52.455～54.215 ℃，酶解pH8.137～8.296，酶解時間3.084～3.427 h。結(jié)合實際可行性，確定最優(yōu)酶解工藝為：雙酶配比1.3 ∶1、酶解溫度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解時間3.4 h，按照回歸方程計算出蛋白胨得率預測值為29.83%。按此條件做驗證試驗，平行測定3 次，結(jié)果分別為28.66%，29.42%，29.76%，取平均值為29.28%，和預測值相近，驗證了該回歸模型的合理性。

圖4 雙酶配比與酶解溫度（a）和酶解時間（b）交互作用效應Fig.4 Interaction effect of double enzyme ratio with hydrolytic temperature（a）and hydrolytic time（b）

表8 各變量取值的頻率分布Table 8 Probability distribution of variables

3 結(jié)論

以脫脂雞副產(chǎn)物為原料，以水解度及蛋白胨得率為考察指標，通過單因素試驗分別比較胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5 種酶在各自最適條件下的水解度及蛋白胨得率，最終確定水解效果最佳、條件差異較小的兩種酶是胰蛋白酶和堿性蛋白酶，其在各自最適條件下水解度及蛋白胨得率分別為：14.49%，23.82%和14.61%，24.40%，因此選擇這兩種酶進行后續(xù)雙酶解試驗。選用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對脫脂雞副產(chǎn)物混合蛋白進行復合酶解制備蛋白胨。

以蛋白胨得率為指標，通過四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化雙酶水解雞副產(chǎn)物制備蛋白胨工藝的數(shù)學回歸模型。在本試驗范圍該模型可預測脫脂雞副產(chǎn)物混合蛋白復合酶解制備蛋白胨的提取率。確定各因素最優(yōu)水平為雙酶配比1.3∶1、酶解溫度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解時間3.4 h，該條件下蛋白胨得率實測值為29.28%。