鄭志強(qiáng) 郝利民 劉 晉 郭順堂

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所 北京100010）

小麥蛋白，俗稱谷朊粉，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)75%～85%，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成[1]。麥醇溶蛋白為單體蛋白，呈球形，由脯氨酸和酰胺等非極性氨基酸組成，非極性側(cè)鏈比極性側(cè)鏈多，單肽鏈間依靠氫鍵、疏水鍵及分子內(nèi)二硫鍵連接，分子無肽鏈間二硫鍵，形成緊密的三維結(jié)構(gòu)；麥谷蛋白是一種非均質(zhì)的大分子聚合體，呈纖維狀，由17～20 種不同的多肽亞基組成，靠二硫鍵連接[1-2]。由于小麥蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，如含有較多的疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，導(dǎo)致分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大，從而使其在水中的溶解性很差。為提高其加工及功能性能，研究者采取多種方法對(duì)其進(jìn)行改性研究，如物理方法、化學(xué)方法和酶解法。蛋白質(zhì)酶解改性反應(yīng)過程溫和、高效、易控、產(chǎn)物安全性高，使得酶解技術(shù)具有傳統(tǒng)熱處理、酸堿處理等改性方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)，因此在小麥蛋白改性方面被廣泛研究和應(yīng)用。通過酶解改性，提高了小麥蛋白的溶解度，同時(shí)也提高了其功能特性。Drago 等[3]提出將小麥蛋白在14%水解度的條件下水解，水解后的溶解度提高了87%，而且溶解的pH 值范圍更大。Bollecker 等[4]研究表明純化的麥醇溶蛋白酶解后，因分子體積減小而顯著提高了其溶解性。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物是多肽和游離氨基酸的混合物，其中含有大量小分子質(zhì)量的多肽，小分子質(zhì)量多肽吸收與氨基酸吸收相比具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，耗能低，可避免氨基酸之間的吸收競(jìng)爭(zhēng)，載體不易飽和等特點(diǎn)，因此更容易被機(jī)體吸收利用，并具備一些特殊的生理功能[5-6]。

小麥肽是小麥蛋白酶解的主要產(chǎn)物，其功能特性受到學(xué)者的廣泛研究，如抗氧化[7-11]、降血壓[12-15]、阿片活性[16-19]、抑癌活性[20-21]等。抗氧化性是小麥肽的主要功能特性，小麥肽含有的抗氧化功效成分可以有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，使機(jī)體免受自由基引起的損傷。清除自由基能力是小麥肽在體內(nèi)或體外體現(xiàn)抗氧化功能的主要指標(biāo)。酶解程度的控制直接決定了具有抗氧化活性肽段生成的多少。酶解過程中用酶的選擇以及酶解的工藝參數(shù)對(duì)小麥肽的抗氧化活性高、低起著重要作用。本課題組前期對(duì)制備高抗氧化活性小麥肽的用酶進(jìn)行了篩選[22]，結(jié)果顯示堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶效果較好。本試驗(yàn)選擇堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶為小麥蛋白的酶解用酶，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除率、超氧陰離子自由基（O2－·）清除率、羥自由基（·OH） 清除率等為反映抗氧化能力的主要指標(biāo)，采用分步酶解方式，對(duì)兩種酶的最佳酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)最終酶解物進(jìn)行超濾分級(jí)分離，確定制備高抗氧化性小麥肽的最優(yōu)工藝參數(shù)以及具有最強(qiáng)抗氧化能力小麥肽的分子質(zhì)量范圍，為高抗氧化性小麥肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥蛋白（蛋白質(zhì)含量82%），商丘華陽生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

堿性蛋白酶 （217 434 U/mL）、風(fēng)味蛋白酶（30 916 U/mL），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

P-2102UV 型紫外分光光度計(jì)，上海新嘉電子有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；BW3200S 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器，上海五相儀器儀表有限公司；CR22G 高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；LNG-UF-101 超濾設(shè)備，上海朗極化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雙酶分步酶解工藝 小麥蛋白100 g→加一定量（按試驗(yàn)要求計(jì)算所得）去離子水混合→在設(shè)定溫度（堿性蛋白酶最適溫度55 ℃）的水浴鍋中保溫→用1.0 mol/L NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)溶液的pH 值于設(shè)定條件（堿性蛋白酶最適pH 值8.5）→加入一定量（按試驗(yàn)要求計(jì)算所得）酶開始酶解→酶解過程中每20 min 用1.0 mol/L NaOH 或HCl調(diào)節(jié)溶液pH 值保持不變→攪拌酶解→酶解結(jié)束后沸水滅酶10 min →調(diào)節(jié)溫度和pH 值至風(fēng)味蛋白酶最適宜條件（溫度50 ℃、pH 6.5）→加入一定量（按試驗(yàn)要求計(jì)算所得）風(fēng)味蛋白酶開始第2步酶解→酶解過程中每20 min 用1.0 mol/L NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 值保持不變→攪拌酶解→酶解結(jié)束后沸水滅酶10 min→冷卻后3 000 r/min 離心20 min→取上清液冷凍干燥→-20 ℃保存待用。

1.3.2 自由基清除率測(cè)定 按照雙酶分步酶解工藝，采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同酶解參數(shù)對(duì)小麥蛋白進(jìn)行酶解，得到相應(yīng)的酶解物，并對(duì)酶解物的DPPH自由基清除率、O2－·清除率、·OH 清除率等分別測(cè)定，DPPH 自由基清除率測(cè)定參照LI 等[23]方法，O2－·清除率測(cè)定參照LI[24]方法，·OH 清除率測(cè)定參照HALLIWELL 等[25]方法。酶解物質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時(shí)測(cè)定自由基清除率。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 不同蛋白酶均有其最適宜的反應(yīng)溫度和pH 值，堿性蛋白酶最適溫度為55℃、最適pH 值8.5，風(fēng)味蛋白酶最適溫度50 ℃、最適pH 值6.5。本試驗(yàn)設(shè)定兩種酶在其對(duì)應(yīng)的最適宜溫度和pH 值條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。

1.3.3.1 堿性蛋白酶酶解單因素試驗(yàn) 對(duì)堿性蛋白酶最適溫度55 ℃、最適pH 值8.5 固定不變，每次試驗(yàn)改變底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間中的一個(gè)因素。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）設(shè)定為4，6，8，10，12，14，16 共7 個(gè)水平值進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，酶含量設(shè)定為2 000 U/g，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為4 h；在酶含量（U/g）設(shè)定為500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，3 500 共7 個(gè)水平值進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為4 h；在反應(yīng)時(shí)間（h）設(shè)定為1，2，3，4，5，6，7 共7 個(gè)水平值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3.2 風(fēng)味蛋白酶酶解單因素試驗(yàn) 采用優(yōu)化的堿性蛋白酶酶解參數(shù)進(jìn)行第1 步酶解的基礎(chǔ)上，開展風(fēng)味蛋白酶第2 步酶解，對(duì)風(fēng)味蛋白酶最適溫度50 ℃、最適pH 值6.5 固定不變，每次試驗(yàn)改變酶濃度和反應(yīng)時(shí)間中的一個(gè)因素。在酶含量（U/g）設(shè)定為500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，3 500 共7 個(gè)水平值進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為4 h；在反應(yīng)時(shí)間（h）設(shè)定為1，2，3，4，5，6，7 共7 個(gè)水平值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 堿性蛋白酶酶解響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響自由基清除效果的主要因素底物濃度X1、酶濃度X2、反應(yīng)時(shí)間X3共3 個(gè)因素為自變量，DPPH 自由基清除率Y1、O2－·清除率Y2、·OH 清除率Y3為因變量，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert V8.0.6 版中Box-Behnken 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的試驗(yàn)，并以-1、0、1 分別代表響應(yīng)因素的低、中、高水平，各因素水平及編碼見表1。

1.3.4.2 風(fēng)味蛋白酶酶解響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響自由基清除效果的主要因素酶濃度X1、反應(yīng)時(shí)間X22 個(gè)因素為自變量，DPPH 自由基清除率Y1、O2－·清除率Y2、·OH 清除率Y3為因變量，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert V8.0.6 版中Central Composite 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)2 因素3 水平試驗(yàn)，各因素水平及編碼見表2。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels used in Central Composite experimental design

1.3.5 超濾分級(jí)分離 選擇堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在最優(yōu)酶解工藝參數(shù)條件下酶解小麥蛋白制得小麥混合肽樣品，該樣品主要由不同分子質(zhì)量的多肽及少量游離氨基酸組成。采用截留分子質(zhì)量分別為5 000，3 000，1 000 u 的超濾膜對(duì)小麥混合肽樣品進(jìn)行分級(jí)分離，獲得Ⅰ組分（分子質(zhì)量大于5 000 u）、Ⅱ組分（分子質(zhì)量3 000～5 000 u）、Ⅲ組分（分子質(zhì)量1 000～3 000 u）、Ⅳ組分（分子質(zhì)量小于1 000 u），所有組分冷凍干燥備用。對(duì)Ⅰ～Ⅳ組分以及小麥混合肽樣品（命名為Ⅴ組分）配制質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的溶液，對(duì)其進(jìn)行DPPH 自由基清除率、O2－·清除率、·OH 清除率的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)自由基清除率的影響 由圖1可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%時(shí)，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，小麥蛋白酶解物的3 種自由基清除能力均有增強(qiáng)的趨勢(shì)；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，DPPH 自由基、O2－·和·OH 清除能力均達(dá)到最大值，分別為56.31%，55.67%和58.46%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，3 種自由基的清除能力均有一定程度的下降。在酶濃度一定的條件下，底物濃度的大小決定了小麥蛋白酶解物生成量的多少，而酶解物的量對(duì)自由基的清除有重要影響，當(dāng)有足夠的酶與底物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，底物濃度越大生成的酶解小分子物質(zhì)越多，這時(shí)酶解物具有很強(qiáng)的自由基清除能力；當(dāng)加入的酶與底物反應(yīng)完全后，再增大底物濃度使底物處于過飽和狀態(tài)，在一定程度上抑制了底物與酶的結(jié)合反應(yīng)。此外，小麥蛋白的溶解性很差，底物濃度太大不利于小麥蛋白的分散，甚至導(dǎo)致小麥蛋白結(jié)團(tuán)，這不利于小麥蛋白的酶解反應(yīng)。選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，小麥蛋白酶解物的自由基清除能力最佳。

2.1.2 酶濃度對(duì)自由基清除率的影響 由圖2可知，酶含量小于2 000 U/g 時(shí)，小麥蛋白酶解物的3種自由基清除能力隨著酶濃度的增大均有增強(qiáng)；酶含量為2 000 U/g 時(shí)，3 種自由基清除能力均達(dá)到最大；酶含量大于2 000 U/g 時(shí)，3 種自由基的清除能力均，平緩下降。底物濃度一定時(shí)，加酶量的多少?zèng)Q定了小麥蛋白酶解反應(yīng)后生成多肽的量，當(dāng)足夠的酶與所有底物完全反應(yīng)后，這時(shí)酶解物生成量最大，清除自由基能力也最強(qiáng)，酶解物濃度與清除自由基能力呈明顯的正相關(guān)[26]。當(dāng)酶超量時(shí)，過量的酶對(duì)小麥蛋白酶解更徹底，可生成大量的氨基酸，而氨基酸過多不利于自由基的清除。同時(shí)，酶添加過多可導(dǎo)致酶之間的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)小麥蛋白酶解反應(yīng)有一定抑制作用。此外，酶的成本也較高。選用適量的酶是蛋白水解的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)酶含量為2 000 U/g 時(shí)，小麥蛋白酶解物清除自由基能力最好。

圖1 不同底物含量對(duì)DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影響Fig.1 Effect of different substrate concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

圖2 不同酶含量對(duì)DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影響Fig.2 Effect of different enzyme concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)自由基清除能力的影響 由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，小麥蛋白酶解物的3 種自由基清除能力均有增強(qiáng)趨勢(shì)，酶解4 h 時(shí)自由基清除能力達(dá)到最大，酶解4 h 后自由基的清除能力趨于穩(wěn)定并略有下降。小麥蛋白與酶的結(jié)合反應(yīng)需要時(shí)間，4 h 內(nèi)反應(yīng)迅速，蛋白與酶充分結(jié)合，生成大量的小麥多肽，這有利于自由基清除效果的快速提升；4 h 時(shí)小麥蛋白與酶反應(yīng)基本結(jié)束，小麥多肽的生成量基本固定，3 種自由基清除能力達(dá)到最大值。4 h 后小麥多肽的量不再顯著增加，自由基清除能力變化不大。小麥多肽與空氣接觸時(shí)間過長可被空氣氧化，使其自由基清除能力有所下降。此外，酶解時(shí)間過長也不利于控制生產(chǎn)成本。選擇小麥蛋白最佳酶解時(shí)間為4 h。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影響Fig.3 Effect of different reaction time on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.2 堿性蛋白酶酶解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸方程：

對(duì)方程中各項(xiàng)以及交互項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Andexperimental results of Box-Behnken experimental design

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4方差分析可知，試驗(yàn)各指標(biāo)所建立的二次回歸模型均極顯著（P＜0.01），各響應(yīng)值的失擬項(xiàng)分別為0.4360，0.1439，0.1826，均大于0.05，不顯著，說明該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合良好，回歸方程不失擬，可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)R2分別為0.9568，0.9435，0.9678，說明響應(yīng)值結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果具有良好的一致性；校正系數(shù)RAdj2分別為0.9013，0.8708，0.9264，說明該模型能解釋90.13%，87.08%，92.64%的響應(yīng)值變化。變異系數(shù)CV 值表示試驗(yàn)本身的精確度，CV值越小，精確度越高，本試驗(yàn)各響應(yīng)值的CV 值分別為4.07%，4.85%，3.78%，CV 值較低，試驗(yàn)的可靠性較高。該模型可用于分析和預(yù)測(cè)堿性蛋白酶第1 步酶解小麥蛋白制備強(qiáng)自由基清除能力小麥肽的工藝，用該模型可較好地優(yōu)化試驗(yàn)方案。

由各因素的顯著性分析可知，一次項(xiàng)底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)3 種自由基清除率均有極顯著影響（P＜0.01），交互項(xiàng)底物濃度與酶濃度對(duì)3種自由基清除率均有顯著或極顯著影響 （P＜0.05或0.01），二次項(xiàng)底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)3種自由基清除率均有顯著或極顯著影響 （P＜0.05或0.01）。由回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值可以看出，酶濃度對(duì)3 種自由基清除率的影響最大。底物濃度與酶濃度的交互作用對(duì)3 種自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。

圖4 底物濃度與酶濃度交互作用對(duì)自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface plots and corresponding contour plots for interactive effect of substrate concentration and enzyme concentration on free radical-scavenging activities

通過Box-Behnken 試驗(yàn)回歸模型得到各響應(yīng)面和等高線圖，圖中橢圓排列越緊密，因素變化對(duì)結(jié)果影響越大；響應(yīng)面坡度越陡，響應(yīng)值對(duì)工藝參數(shù)的變化越敏感，該參數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大；等高線的形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反[27]。由圖4可知，3 種自由基清除率對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖的變化趨勢(shì)類似，底物濃度與酶濃度二者間的交互作用對(duì)3 種自由基清除率均有顯著影響。當(dāng)酶濃度固定不變時(shí)，隨著底物濃度的增加，3 種自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，下降趨勢(shì)不明顯，酶濃度越高，3 種自由基清除率隨底物濃度的增加而增長越快；當(dāng)?shù)孜餄舛裙潭ú蛔儠r(shí)，隨著酶濃度的增加，3 種自由基清除率快速上升，上升至一定程度后下降，底物濃度越高，3 種自由基清除率隨酶濃度的增加而增長越快。由等高線圖可看出，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在11%～12%，酶含量在2 000～2 300 U/g 范圍，3 種自由基清除率可優(yōu)化出最大值。

采用Design-Expert V8.0.6 分析軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行模擬優(yōu)化，得出堿性蛋白酶第1 步酶解最佳酶解工藝參數(shù)為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.20%、酶含量2 220.09 U/g、反應(yīng)時(shí)間4.32 h，這時(shí)預(yù)測(cè)的DPPH 自由基清除率為60.25%，O2－·清除率為58.86%，·OH 清除率為61.05%。

2.3 堿性蛋白酶酶解最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

圖5 不同酶含量對(duì)DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影響Fig.5 Effect of different enzyme concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，便于實(shí)際生產(chǎn)操作，將堿性蛋白酶第1 步酶解最佳工藝參數(shù)調(diào)整為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.2%，酶含量2 200 U/g、反應(yīng)時(shí)間4.3 h，反應(yīng)pH 值8.5，反應(yīng)溫度55 ℃，在此工藝參數(shù)條件下，實(shí)測(cè)DPPH 自由基清除率為59.88%，O2－·清除率為58.12%，·OH 清除率為60.53%。實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值較為接近，說明該回歸方程建立的模型與實(shí)際情況擬合較好，優(yōu)化酶解工藝參數(shù)較可靠。

2.4 風(fēng)味蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

采用堿性蛋白酶按上一步優(yōu)化好的最佳酶解工藝參數(shù)酶解小麥蛋白，酶解結(jié)束后迅速高溫滅酶；調(diào)節(jié)溫度和pH 值至風(fēng)味蛋白酶最適宜條件：溫度50 ℃、pH 值6.5；添加風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第2步酶解。

2.4.1 酶濃度對(duì)自由基清除率的影響 由圖5可知，風(fēng)味蛋白酶添加量為1 000 U/g 時(shí)，小麥蛋白酶解物的3 種自由基清除能力均達(dá)到最大值，當(dāng)酶含量大于1 000 U/g 時(shí)，3 種自由基的清除能力均呈下降趨勢(shì)。第2 步酶解過程中，酶濃度越大，對(duì)小麥蛋白的酶解越徹底，大量肽鏈斷裂為游離氨基酸，由多肽變?yōu)榘被?，?duì)自由基清除能力的影響很大，雖然部分氨基酸如His、Tyr、Met 等具有清除自由基的功能[28-29]，但在小麥蛋白酶解物中，分子質(zhì)量較小的多肽對(duì)清除自由基功能仍起主要作用。例如WANG 等[10]研究發(fā)現(xiàn)小麥蛋白酶解物中分子質(zhì)量小于5 000 u 的多肽在中性條件下具有與維生素E 幾乎相同的抗氧化能力，其中分子質(zhì)量為4 200 u 的多肽占86.5%，并具有較高的抗氧化活性。從提高自由基清除角度出發(fā)，分子質(zhì)量較小的多肽生成量越多，對(duì)自由基清除越有利。本試驗(yàn)研究確定第2 步酶解中風(fēng)味蛋白酶的添加量為1 000 U/g 對(duì)自由基清除效果最佳，這時(shí)測(cè)得DPPH 自由基清除率為71.24%，O2-·清除率為68.31%，·OH 清除率為72.06%。

圖6 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影響Fig.6 Effect of different reaction time on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.4.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)自由基清除率的影響 由圖6可知，第2 步酶解時(shí)間為2 h 時(shí)，小麥蛋白酶解物的3 種自由基清除能力均達(dá)到最大值；酶解時(shí)間2～4 h 時(shí)，3 種自由基的清除能力均呈基本穩(wěn)定狀態(tài)，下降不明顯；酶解時(shí)間大于4 h 后，3 種自由基的清除能力均呈明顯下降趨勢(shì)。第2 步酶解過程中，酶解時(shí)間大于2 h，自由基清除能力隨著酶解時(shí)間的延長下降越來越快，這是由于隨著酶解時(shí)間的延長，小麥蛋白酶解徹底，酶解生成的具有清除自由基能力的小麥肽進(jìn)一步水解而減弱其清除自由基能力。第2 步風(fēng)味蛋白酶酶解適宜時(shí)間為2 h，這時(shí)測(cè)得DPPH 自由基清除率為76.59%，O2-·清除率為74.1%，·OH 清除率為77.85%。

2.5 風(fēng)味蛋白酶酶解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸方程：

對(duì)方程中各項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Central Composite experimental design and experimental results

表6 回歸方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

由表6方差分析可知，通過各指標(biāo)建立的二次回歸模型均極顯著（P＜0.01），各響應(yīng)值的失擬項(xiàng)均大于0.05，不顯著，說明該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合良好，回歸方程不失擬，可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)R2分別為0.9404，0.9673，0.9602，說明響應(yīng)值結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果具有良好的一致性；校正系數(shù)RAdj2分別為0.8979，0.9439，0.9317，說明該模型能分別解釋89.79%，94.39%，93.17%的響應(yīng)值的變化。本試驗(yàn)各響應(yīng)值的變異系數(shù)CV 值分別為3.2%，1.97%，2.5%，CV 值較低，說明試驗(yàn)的可靠性較高。該模型可用于分析和預(yù)測(cè)風(fēng)味蛋白酶第2 步酶解小麥蛋白，制備強(qiáng)自由基清除能力小麥肽的工藝，用該模型可較好地優(yōu)化試驗(yàn)方案。由各因素的顯著性分析可知，一次項(xiàng)酶濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)3 種自由基清除率均有顯著影響（P＜0.05），交互項(xiàng)酶濃度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)3 種自由基清除率均無顯著影響，二次項(xiàng)酶濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)3 種自由基清除率均有極顯著影響（P＜0.01）。

采用Design-Expert V8.0.6 分析軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行模擬優(yōu)化，得出風(fēng)味蛋白酶第2 步酶解最佳酶解工藝參數(shù)為：酶含量1 072.73 U/g、反應(yīng)時(shí)間2.17 h，這時(shí)預(yù)測(cè)的DPPH 自由基清除率為76.12%，O2-·清除率為75.38%，·OH 清除率為76.94%。

2.6 風(fēng)味蛋白酶酶解最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，便于實(shí)際生產(chǎn)操作，將風(fēng)味蛋白酶第2 步酶解最佳工藝參數(shù)調(diào)整為酶含量1 070 U/g，反應(yīng)時(shí)間2.2 h，反應(yīng)pH 值6.5，反應(yīng)溫度50 ℃，在此工藝參數(shù)條件下，實(shí)測(cè)DPPH 自由基清除率為75.36%，O2-·清除率為74.51%，·OH 清除率為76.29%。實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值較為接近，說明由該回歸方程建立的模型與實(shí)際情況擬合較好，優(yōu)化酶解工藝參數(shù)較可靠。

2.7 不同分子質(zhì)量小麥肽組分對(duì)自由基清除率的影響

圖7 不同分子質(zhì)量小麥肽組分對(duì)自由基清除率的影響Fig.7 Effect of wheat peptides with different molecular weight on radical scavenging activities

由圖7可知，小麥肽分子質(zhì)量不同，對(duì)3 種自由基清除率均有一定影響，分子質(zhì)量越小，自由基清除效果越好，其中分子質(zhì)量小于1 000 u 的組分3 種自由基清除率最高（P＜0.05），其次是小麥混合肽樣品，二者自由基清除效果接近，說明小麥混合肽樣品中的主要組分是分子質(zhì)量小于1 000 u 的小肽。酶解物中小分子質(zhì)量的多肽所占比例越大，代表其水解程度越高，對(duì)應(yīng)的抗氧化能力也越強(qiáng)。大量研究[8，11，30]表明，小分子質(zhì)量小麥肽相較大分子質(zhì)量的小麥肽具有更高的抗氧化活性。本試驗(yàn)制備的小麥肽樣品具有較高的自由基清除能力，說明小麥蛋白雙酶酶解效果較好，有利于賦予小麥肽較高的抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶分步酶解方式酶解小麥蛋白制備高抗氧化性小麥肽，得到雙酶酶解的最優(yōu)工藝參數(shù)：第1 步堿性蛋白酶底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.2%、酶含量2 200 U/g、pH 值8.5、溫度55 ℃、酶解時(shí)間4.3 h；第2 步風(fēng)味蛋白酶酶含量1 070 U/g、pH 值6.5、溫度50 ℃、酶解時(shí)間2.2 h。最終酶解物DPPH 自由基清除率為75.36%，O2-·清除率為74.51%，·OH 清除率為76.29%，其中分子質(zhì)量小于1 000 u 組分自由基清除率最高。