齊獻忠 邢英瀛 秦慧兵

(南陽市中心醫(yī)院神經內科，河南 南陽 473000)

帕金森病(PD)主要是由中樞神經系統(tǒng)腦細胞中多巴胺能神經元的損失造成的，通常表現(xiàn)為運動障礙〔1,2〕。PD在神經退行性疾病發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，其發(fā)病率約為全球65歲以上人口的2%〔3〕。慢性活性氧(ROS)水平的增加或ROS消除能力的降低均稱為氧化應激(OS)〔4〕。研究顯示，OS在多巴胺神經元的退化、死亡中發(fā)揮關鍵性作用〔5〕。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有效的可保護或逆轉PD的神經退行藥物。含有Src同源結構域2的銜接蛋白(SHC)家族包括SHCA、SHCB、SHCC(SHC3)、SHCD，其在哺乳動物中均具有特異的原型信號傳導細胞,其中SHC3已被證明僅限于神經元細胞〔6〕且在典型成熟神經元中表達〔7〕。據報道，磷酸肌酶-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-FoxO、PI3K-AKT、PKCβ/p66Shc、FoxO/Wnt、p66Shc/IQGAP1/核因子NF-E2相關因子(Nrf)2及AKT/Nrf2/谷胱甘肽(GSH)等通路均參與調控OS〔8～11〕。其中PI3K-AKT-FoxO和AKT/Nrf2/GSH通路調控PD中的氧化應激已得到證實〔11〕。但SHC3與AKT/Nrf2/GSH通路在PD中的作用關系尚未清楚。本研究擬分析過表達SHC3對PC12細胞氧化應激、凋亡及細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細胞購自上海生命科學研究院細胞中心；1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)購自瑞士SIGMA；乳酸脫氫酶(LDH)、ROS、丙二醛(MDA)、GSH測定試劑盒購自賽默飛公司;聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、qRT-PCR試劑盒、噻唑藍(MTT)、脂質體LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒購于大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購于碧云天生物技術公司；Nano-Drop 2000微量分光光度計(美國Thermo公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購于美國ABI公司；細胞培養(yǎng)箱購于美國Forma Scientific公司；PCR 儀購于美國BIO-RAD公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞，置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。正常組：取上述培養(yǎng)細胞不做任何處理；模型組：用250 mmol/L的MPP+處理PC12細胞24 h，構建PD細胞模型；模型+NC組：將載體pcDNA3.1用脂質體法轉染至PC12細胞，轉染成功后，按照模型組操作處理細胞；模型+SHC3組：將pcDNA3.1-SHC3轉染至PC12細胞，轉染成功后，按照模型組操作處理細胞。將以上各處理組細胞進行qRT-PCR實驗、Western印跡實驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。

1.3qRT-PCR實驗 取適量對數(shù)生長期各組細胞進行Trizol法提取細胞總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉錄反應采用逆轉錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。按照反應體系進行，每個樣品重復3次，取平均值，反應結束后通過分析Ct值，計算定量結果，以2-△△Ct法測定SHC3 mRNA的相對表達水平。

1.4Western印跡實驗 取適量對數(shù)生長期各組細胞，用RIPA蛋白裂解液進行冰上蛋白裂解1 h，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液(×5)，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg目的蛋白、蛋白Marker進行SDS-PAGE。然后將蛋白濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入1∶1 000倍稀釋的一抗中反應過夜，以封閉液洗膜3次，每次5 min，再在37℃下將PVDF膜轉入1∶2 000倍稀釋的二抗中反應2 h。于暗室內ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62圖像分析軟件進行條帶灰度分析，以β-actin為內參，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白SHC3、B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl)-2、Bcl-2關聯(lián)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、p-AKT、Nrf2的表達情況。

1.5ELISA試驗 取適量對數(shù)生長期各組細胞，離心取上清。

1.6MTT實驗 取適量對數(shù)生長期各組細胞，加入20 μl、5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后吸去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩待結晶充分溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。每組設5個重復孔，實驗重復3次。細胞活性與A490值呈正相關。

1.7膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測 取適量對數(shù)生長期各組細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 2次。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒中的說明書要求操作，最后用流式細胞儀檢測并分析測定結果。每個樣品重復3次。細胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+晚期凋亡率 (Annexin V+/PI+)。

1.8統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism7.0進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1構建過表達SHC3的PC12細胞模型 與正常組相比，模型組、模型+NC組SHC3 mRNA和SHC3蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，模型+SHC3組SHC3 mRNA和SHC3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型+NC組相比，模型+SHC3組SHC3 mRNA和SHC3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 各組細胞中SHC3 mRNA、SHC3蛋白表達量

與正常組比較:1)P<0.05；與模型+NC組比較:2)P<0.05；下表同

圖1 各組SHC3的蛋白表達

2.2過表達SHC3對MPP+誘導PC12細胞氧化應激損傷的影響 與正常組相比，模型組、模型+NC組、模型+SHC3組ROS、MDA含量顯著升高，GSH含量顯著降低(P<0.05)；與模型+NC組相比，模型+SHC3組ROS、MDA含量顯著降低，GSH含量顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組氧化應激分子ROS、MDA、GSH的含量

2.3過表達SHC3對MPP+誘導PC12細胞活性的影響 與正常組相比，模型組、模型+NC組、模型+SHC3組LDH含量顯著升高，細胞活性顯著降低(P<0.05)；與模型+NC組相比，模型+SHC3組LDH含量顯著降低，細胞活性顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組LDH含量和細胞活性比較

2.4過表達SHC3對MPP+誘導PC12細胞凋亡的影響 與正常組相比，模型組、模型+NC組、模型+SHC3組細胞凋亡率、Bcl-2/Bax蛋白表達量、caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與模型+NC組相比，模型+SHC3組均顯著降低(P<0.05)，見表4，圖2。

2.5過表達SHC3激活AKT/Nrf2/GSH通路 模型組、模型+NC組、模型+SHC3組與正常組p-AKT、Nrf2蛋白表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型+SHC3組與模型+NC組相比，p-AKT、Nrf2蛋白表達量顯著升高，見表5，圖3。

表4 各組細胞凋亡率及凋亡蛋白Bcl-2/Bax、caspase-3表達量比較

圖2 各組細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達

組別p-AKTNrf2正常組1.00±0.051.00±0.06模型組0.72±0.091)0.63±0.071)模型+NC組0.79±0.091)0.59±0.061)模型+SHC3組1.84±0.171)2)1.66±0.161)2)F值67.01578.196P值0.0000.000

圖3 各組p-AKT、Nrf2蛋白表達

3 討 論

PD作為世界第二常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，在全球的患者超過10萬例〔12,13〕。雖然PD在動物模型中進行了廣泛的研究，但仍缺乏有效的保護PD神經藥物〔14〕。SHC蛋白家族的特征是(CH2)-PTB-CH1-SH2模塊化。最初從果蠅中的一個位點(dShc)演變到哺乳動物中的3個位點(shc，rai和sli)。由于其啟動密碼子的剪接，哺乳動物的3個基因至少編碼6種Shc蛋白,且這些蛋白質均具有與氨基末端的磷酸酪氨酸激酶受體結合的PTB結構域和CH2結構域及與Grb2結合的CH1結構域。SHC3蛋白由兩種異構體(p66SHC3和p52SHC3)組成，前者比后者多了一個CH2結構域。SHC3僅在成熟神經細胞中表達〔15〕。Troglio等〔16〕發(fā)現(xiàn)，Rai可提高小鼠神經元細胞的缺氧或氧化應激誘導的細胞凋亡并增加缺血再灌注誘導的小鼠神經細胞凋亡和梗死面積，其機制可能為Rai作為應激反應基因，在低氧或氧化損傷后激活PI3K/AKT，揭示Rai在腦損傷中具有功能性神經保護作用。Gong等〔17〕研究表明，沉默SHC3可導致運動遲緩，且沉默SHC3抑制AKT和FoxO磷酸化的程度，失活PI3K/AKT/FoxO信號通路。本研究揭示了過表達SHC3可抑制PC12細胞凋亡。

氧化應激是機體或細胞內氧自由基的產生與清除失衡,導致ROS和活性氮在體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程，其常見的檢測指標有ROS、SOD、MDA、一氧化氮(NO)和GSH〔18〕。GSH參與H2O2的還原反應，其為腦內最重要的自由基清除系統(tǒng)。MDA為過氧化脂質的降解產物，其含量可反映過氧化脂質的水平。ROS為分子氧經過線粒體代謝的副產物，其含量可反映氧化應激強度。LDH為細胞質酶，在細胞膜通透性增高時，LDH露出細胞外，反映細胞的損傷及活力〔19〕。孟凜冽等〔20〕研究表明，黑質多巴胺神經元缺損與線粒體功能障礙、鈣超載、鐵離子堆積、免疫炎癥等造成的氧化性損傷有關,且其可促進多巴胺能神經元凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達SHC3可保護MMP+誘導的PC12細胞氧化應激水平，增強細胞活力。

Nrf2是維護氧化還原平衡的關鍵調節(jié)因子,尤其是在持續(xù)激活PI3K-AKT信號的條件下。活化的PI3K-AKT通路增強Nrf2在核內的積累,使Nrf2促進具有抗氧化、抗炎、抗凋亡基因的表達〔21,22〕。Du等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，人參主要活性成分(Rg1)對鐵毒性神經具保護作用，其機制為激活AKT/Nrf2途徑及增加Nrf2誘導的HO-1和Cu/Zn SOD表達的抗氧化，為PD發(fā)病機制及治療提供依據。Gunjima等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，3,4-二羥基苯甲酰丙酮(DBL)可逆轉SH-SY5Y細胞的PD相關神經毒素6-羥基多巴胺的神經毒性，其機制為通過PI3K/AKT激活Nrf2/GSH途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達SHC3可逆轉MMP+誘導損傷PC12細胞中p-AKT、Nrf2蛋白表達及GSH含量，揭示過表達SHC3激活AKT/Nrf2/GSH通路。 綜上，過表達SHC3可保護PD的氧化應激損傷，其機制與激活AKT/Nrf2/GSH通路有關，為PD的治療及發(fā)病機制的研究奠定理論基礎。