劉華松 徐蘭蘭

(1十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院胸心大血管外科，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院)

食管癌是常見的惡性實(shí)體腫瘤，由于容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致治療效果差〔1〕。順鉑是治療食管癌的一線化療藥，其主要作用是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷和氧化應(yīng)激，然而隨著化療周期的增加腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)DNA修復(fù)能力和對(duì)順鉑的生物轉(zhuǎn)化增強(qiáng)而對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥〔2〕。因此，尋找提高腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性的臨床化療佐劑成為研究熱點(diǎn)。氨磷汀是一種廣譜細(xì)胞保護(hù)劑，既能降低甚至消除化療藥物的毒副作用，又不降低藥物療效，在臨床上已經(jīng)作為一些腫瘤化療的佐劑，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性〔3，4〕。目前尚未見到氨磷汀對(duì)順鉑耐藥的人食管癌細(xì)胞化療敏感性影響的相關(guān)報(bào)道。本文體外研究氨磷汀對(duì)人食管癌細(xì)胞株ECA109順鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人食管癌細(xì)胞株ECA109本室保存。氨磷汀、順鉑(美國(guó)Sigma公司)；RPMI1640(美國(guó)Gibco公司)，B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白(MRP)1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 ①對(duì)照組：未進(jìn)行藥物處理；②順鉑組：在培養(yǎng)液中加入2.0 mg/L順鉑；③氨磷汀組：在培養(yǎng)液中分別加入0、5、10、20 μg/ml的氨磷??；④聯(lián)合組：在培養(yǎng)液中加入2.0 mg/L順鉑和10 μg/ml的氨磷汀。其中氨磷汀組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；其他各組于培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以7×103/200 μl的密度接種于96孔培養(yǎng)板各孔內(nèi)，空白對(duì)照孔僅加入200 μl完全培養(yǎng)液。按照上述分組情況在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，各體系均設(shè)6個(gè)平行孔。測(cè)量前，每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液各20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)輕搖混勻10 min至結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 收集四組ECA109細(xì)胞，其中氨磷汀組只選取10 μg/ml濃度組，各組均在培養(yǎng)48 h后制成細(xì)胞懸液，以105/ml的濃度接種于6孔板中，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組反應(yīng)體系為2 ml，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞離心后與Annexin V及碘化丙啶(PI)作用15 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率，計(jì)算增殖指數(shù)。

1.5Western印跡檢測(cè)耐藥蛋白與凋亡蛋白的表達(dá) 取對(duì)照組、順鉑組、氨磷汀(10 μg/ml)組和聯(lián)合組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后提取全細(xì)胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離和轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗Bcl-2、Bax、MRP1和β-actin，4 ℃過夜，次日滴加二抗(1∶1 000)37 ℃避光孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，用Odyssey掃描系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)及灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，用目標(biāo)蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1氨磷汀對(duì)ECA109細(xì)胞增殖抑制率的影響 與對(duì)照組比較，隨著氨磷汀作用濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性未見明顯改變(P>0.05)，見表1。

表1 氨磷汀對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)ECA109細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ECA109細(xì)胞增殖活性的影響 與對(duì)照組(A值：1.001±0.001)和氨磷汀組(A值：0.997±0.002)、順鉑組(A值：0.519±0.052)比較，聯(lián)合組可顯著降低細(xì)胞增殖活性(A值：0.283±0.036，均P<0.01)。

2.3氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ECA109細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，聯(lián)合組細(xì)胞G0/G1期和凋亡率明顯升高(P<0.01)，增殖指數(shù)、S期和G2/M期明顯降低(P<0.01)；與順鉑組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，增殖指數(shù)、S期和G2/M期明顯降低(P<0.01)；對(duì)照組、順鉑組和氨磷汀組G0/G1期、S期和G2/M期、增殖指數(shù)和凋亡率無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ECA109細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與順鉑組比較：2)P<0.01；與氨磷汀組比較：3)P<0.01，下表同

2.4氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ECA109細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組和順鉑組比較，聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和MRP1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；氨磷汀組細(xì)胞內(nèi)MRP1明顯降低(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 氨磷汀聯(lián)合順鉑對(duì)ECA109細(xì)胞Bcl-2、Bax和MRP1蛋白表達(dá)的影響

組別Bcl-2BaxMRP1對(duì)照組0.623±0.0190.430±0.0130.386±0.011順鉑組0.304±0.0120.452±0.0180.127±0.008氨磷汀組0.589±0.0170.461±0.0200.408±0.014聯(lián)合組0.117±0.0091)2)3)0.455±0.0160.051±0.0021)2)3)

3 討 論

氨磷汀是第一個(gè)被國(guó)際上廣泛認(rèn)可的細(xì)胞保護(hù)劑，在臨床上用于減輕放療引起的副作用〔5〕。研究還發(fā)現(xiàn)氨磷汀與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可以減輕化療藥物的全身毒性作用，提高化療劑量與強(qiáng)度，從而提高化療藥物的臨床療效〔6～8〕。

化療是惡性腫瘤綜合治療中的主要方法之一，療效降低的主要問題是對(duì)正常細(xì)胞的損傷和耐藥的發(fā)生〔9〕。逐漸興起的細(xì)胞保護(hù)劑主要用來預(yù)防和減輕放化療引起的正常組織細(xì)胞的毒性作用，提高患者的耐受性與順應(yīng)性，從而提高化療效果和患者生活質(zhì)量〔10〕。有研究表明氨磷汀主要分布在正常組織細(xì)胞內(nèi)，極少分布于腫瘤組織內(nèi)，在不影響化療藥物抗腫瘤活性的同時(shí)選擇性地保護(hù)正常組織，甚至在一些臨床研究中發(fā)現(xiàn)氨磷汀發(fā)揮化療增敏作用〔11～13〕。本研究結(jié)果說明氨磷汀可能對(duì)細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，至少氨磷汀不會(huì)對(duì)ECA109細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，此結(jié)果與王根菊等〔14〕的結(jié)果研究一致。

食管癌是發(fā)生于食管黏膜上皮組織的惡性度較高的腫瘤，臨床上仍以手術(shù)前化療結(jié)合術(shù)后輔助化療為主要手段改善食管癌患者的長(zhǎng)期生存率〔15〕。目前，順鉑是治療進(jìn)展期食管鱗癌的常用藥物，但高劑量重復(fù)用藥往往引起全身多器官系統(tǒng)的損傷和耐藥，很大程度上限制了順鉑的應(yīng)用〔16〕。因此，提高食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性并降低順鉑的毒副作用成為臨床化學(xué)藥物治療食管癌的主要策略。本研究結(jié)果表明氨磷汀可能并不直接導(dǎo)致ECA109細(xì)胞增殖抑制或凋亡。同時(shí)，氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞的凋亡率卻較順鉑組明顯增加，說明氨磷汀可以提高ECA109細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，二者發(fā)揮協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，通常用Bcl-2/Bax 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的比值來判斷凋亡過程是否是Bcl-2蛋白介導(dǎo)的〔17〕。本研究結(jié)果表明氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可以誘導(dǎo)更顯著的細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞的重要特征是持續(xù)分裂增殖，細(xì)胞的增殖通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)〔18〕。細(xì)胞周期包括S期與M期兩個(gè)功能階段和G1期與G2期兩個(gè)準(zhǔn)備階段，各期的細(xì)胞內(nèi)DNA含量不同，以此檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性〔19〕。本研究結(jié)果表明氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用阻止細(xì)胞DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞增殖，與細(xì)胞凋亡結(jié)果一致。MRP1是食管癌發(fā)生耐藥的相關(guān)耐藥蛋白，本研究結(jié)果顯示，氨磷汀與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可以明顯降低ECA109細(xì)胞MRP1的表達(dá)，同時(shí)，氨磷汀單純用藥組也能降低MRP1蛋白的表達(dá)，表明氨磷汀可以提高食管癌細(xì)胞的化療敏感性。

綜上所述，本研究證實(shí)，氨磷汀雖然不具有明顯的抑制食管癌細(xì)胞增殖的作用，但可提高食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。