呂蓉蓉 齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 承德 067000)

胃癌是高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在不同區(qū)域間存在較大差異，但中國(guó)的發(fā)病率依然居于世界首位〔1〕。胃腺癌是胃癌常見(jiàn)的一種類型，病人預(yù)后較差，死亡率也比較高，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程涉及多種調(diào)控機(jī)制，主要與原癌基因的異常激活、腫瘤抑制基因失活和凋亡調(diào)控基因異常表達(dá)有關(guān)〔2〕。最近發(fā)現(xiàn)了一種重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白(CCAR)1，可與多個(gè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡信號(hào)，促進(jìn)發(fā)生細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，它在細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用〔3〕。目前國(guó)外關(guān)于CCAR1在胃癌中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道，國(guó)內(nèi)關(guān)于其在胃腺癌組織中的表達(dá)也未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討胃腺癌組織中CCAR1 mRNA和蛋白的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1組織標(biāo)本 收集在承德地區(qū)多所醫(yī)院近2年行手術(shù)治療的胃癌患者組織標(biāo)本60例，后經(jīng)病理診斷為胃腺癌，胃癌患者手術(shù)前均未行放化療，年齡41～85歲，高分化28例，中分化19例，低分化13例；同期選擇40例鄰近的癌旁正常胃黏膜組織(距離胃癌組織邊緣>5 cm)，包括女15例、男25例，年齡35～78歲。

1.2免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)法檢測(cè)CCAR1蛋白 將所收集的樣品用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片。采用免疫組化SP法及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色法檢測(cè)CCAR1蛋白的表達(dá)，并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。CCAR1抗體購(gòu)自聯(lián)科生物公司，使用濃度為1∶200。陽(yáng)性對(duì)照切片使用確定具有陽(yáng)性表達(dá)的切片，空白對(duì)照切片使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由兩位高年資的病理醫(yī)師通過(guò)雙盲法按照先低倍后高倍的順序在顯微鏡下觀察切片并進(jìn)行診斷，每個(gè)部分隨機(jī)選擇4個(gè)高倍下視野(×400)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。染色程度：0分為未著色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色；染色細(xì)胞所占的比例：0分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%，1分為≥5%且<25%，2分為≥25%且<50%，3分為≥50%。將上述兩項(xiàng)得分相乘得到最終結(jié)果：0～1分即CCAR1蛋白陰性表達(dá)，≥2分即陽(yáng)性〔4〕。

1.3Western印跡法檢測(cè)CCAR1蛋白 所收集新鮮標(biāo)本長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80℃低溫條件下，實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取約0.1 g新鮮組織，加入1 ml細(xì)胞放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液后充分研磨、裂解，提取組織中的總蛋白，并按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒的要求對(duì)所提蛋白的濃度進(jìn)行檢測(cè)，取30 μg蛋白上樣量并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。內(nèi)參β-actin抗體濃度為1∶3 000，兔抗人CCAR1抗體濃度為1∶1 500，4℃過(guò)夜。次日加入二抗，濃度為1∶14 000，孵育后應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光液進(jìn)行顯影并采集圖像。利用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)條帶的灰度值，以靶蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比率作為靶蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)CCAR1 mRNA 將0.1 g組織置于已除去核糖核酸酶(RNase)的EP管中，按照說(shuō)明書(shū)提取組織中的總RNA。將總RNA提取劑(TRIzol)加入新鮮組織中，放入組織研磨儀充分研磨提取組織總RNA，檢測(cè)RNA濃度并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。CCAR1基因引物序列上游為5′-GCTATTCGTTGTAAGGCTCTG-3′，下游為5′-TCTCCACATGAGCTGGAACTGTA-3′。內(nèi)參GAPDH的引物序列上游是5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游是5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按照試劑盒要求將引物、cDNA等加入無(wú)酶EP管中輕彈混勻，通過(guò)qRT-PCR獲得靶基因及內(nèi)參的Ct值，與正常胃黏膜相比，胃腺癌組織中靶基因表達(dá)的倍數(shù)以2-△△Ct表示。每例標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次試驗(yàn)后取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCAR1蛋白和mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CCAR1蛋白陽(yáng)性率、CCAR1蛋白和mRNA的表達(dá)與胃腺癌患者的年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，與胃腺癌的分化程度有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 CCAR1蛋白陽(yáng)性率、蛋白和mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

1)P<0.05

2.2免疫組化SP法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 CCAR1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要出現(xiàn)在細(xì)胞核，但也可見(jiàn)于胞質(zhì)中，在胃腺癌組織中的CCAR1蛋白陽(yáng)性率〔81.6%(49/60)〕顯著高于正常胃黏膜組織〔32.5%(13/40),P<0.05〕，見(jiàn)圖1。

2.3Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在胃腺癌中，CCAR1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.82±0.15)顯著高于鄰近的癌旁正常胃黏膜(0.50±0.09,P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在胃腺癌組織中，CCAR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.28±1.21)顯著高于正常胃黏膜(0.94±0.18,P<0.05)。

圖1 CCAR1蛋白的表達(dá)(SP法，×400)

圖2 CCAR1蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)每年新發(fā)癌癥約429萬(wàn)例，占全球新發(fā)病例總數(shù)的20%，腫瘤的預(yù)防已成為我國(guó)亟待解決的重要問(wèn)題〔5〕。胃腺癌的早期癥狀不典型，待其出現(xiàn)明顯癥狀與體征時(shí)多已屬中晚期，分化程度差，預(yù)后不佳。胃腺癌的發(fā)生是多方面因素綜合作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制涉及眾多基因和分子信號(hào)通路〔6〕，不僅涉及腫瘤細(xì)胞的異常增殖，也與細(xì)胞凋亡的抑制存在密切關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是凋亡相關(guān)基因在某些生理和病理?xiàng)l件下調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。CCAR1蛋白是一種核內(nèi)磷酸化蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)其可以介導(dǎo)化療藥物引起的人類乳腺癌細(xì)胞的凋亡，它以基因特異性的方式發(fā)揮作用，并在不同的靶基因上發(fā)揮不同的作用機(jī)制〔7〕。在Wnt通路中，CCAR1可以共激活β-連環(huán)蛋白(catenin)，并協(xié)助β-catenin促進(jìn)Wnt通路中的下游基因包括癌基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7等表達(dá)；CCAR1與泛素連接酶(APC/C)亞基APC-2結(jié)合發(fā)生相互作用，并與細(xì)胞分裂周期蛋白20、上皮-鈣黏連素1共激活A(yù)PC/C；而在CCAR1功能模擬物存在的情況下，CCAR1與APC-2結(jié)合受到抑制并阻止細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，促進(jìn)激活Caspase泛素蛋白酶途徑，導(dǎo)致CyclinB1蛋白缺失，從而控制細(xì)胞的生物學(xué)活性，調(diào)控細(xì)胞的周期〔8〕。CCAR1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以通過(guò)與腫瘤抑制基因P53的結(jié)合及調(diào)節(jié)周期蛋白依賴性激酶(CDK)1和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子的水平作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，它還可以作為促凋亡信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡〔9〕。研究揭示了CCAR1參與多種細(xì)胞類型包括不同癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖及凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)與相應(yīng)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白及細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白結(jié)合，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡信號(hào)，并發(fā)揮了重要作用〔10〕。Seo等〔11〕研究顯示，在前列腺癌組織中CCAR1 mRNA和蛋白與正常前列腺組織相比表達(dá)增加，其表達(dá)異常升高可引起前列腺癌細(xì)胞對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制，從而導(dǎo)致了前列腺癌的發(fā)生；在肝細(xì)胞癌〔12〕的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，CCAR1蛋白在肝細(xì)胞癌中表達(dá)量增加，并促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及微血管浸潤(rùn)。還有研究表明在肺癌的治療過(guò)程中，CCAR1的表達(dá)量下調(diào)〔13〕，提示其表達(dá)量的升高或與肺癌的發(fā)生具有一定的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示CCAR1 mRNA、蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨著胃腺癌分化程度的不斷降低均出現(xiàn)明顯增加。在基因水平和蛋白水平上CCAR1在胃腺癌組織中表達(dá)增高與CCAR1在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明其在胃腺癌的發(fā)生過(guò)程中具有重要的促進(jìn)作用，并可能與胃腺癌的進(jìn)展有關(guān)。

隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展，人們?cè)诿鞔_腫瘤的發(fā)生和分子機(jī)制方面取得了一定的進(jìn)展，對(duì)于腫瘤的治療也有一定的突破。但是，許多抗癌治療成功結(jié)果往往是短暫的，很大一部分原因是治療藥物的毒副作用及出現(xiàn)耐藥性癌癥。因此，有必要不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生過(guò)程中異常表達(dá)的因子和分子途徑，以便開(kāi)發(fā)新的治療策略。CCAR1 mRNA、蛋白在胃腺癌組織中表達(dá)升高，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮了一定的抑制作用并促進(jìn)了胃腺癌的發(fā)生。隨著CCAR1表達(dá)增加，胃腺癌細(xì)胞的凋亡減少，提示CCAR1在一定程度上可作為分子生物學(xué)標(biāo)記來(lái)判斷胃腺癌的發(fā)生。后期可進(jìn)一步研究CCAR1的表達(dá)機(jī)制，或可為胃腺癌的精確診斷及靶向治療提供新的思路。