楊照新 田樹紅 黃綿慶 劉 瑩 林春華 肖 敏 黃 凌

(海南醫(yī)學院，?？?571199)

目前T細胞依賴性抗體反應(T cell-dependent antibody response,TDAR)實驗被認為是能夠較好地檢測藥物免疫毒性反應的功能性實驗，它通過引入異體抗原，反映機體免疫功能，以預測藥物的免疫毒性，并在免疫毒理學研究中得到廣泛重視[1,2]。本研究通過制備BALB/c小鼠免疫功能低下的模型動物，以血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)作為T細胞依賴性抗原，分析和考察環(huán)磷酰胺對小鼠TDAR的影響，并對外周血淋巴細胞亞群及免疫器官形態(tài)學等指標進行綜合分析和評價，探討以KLH為特異性抗原的TDAR實驗定量分析的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級BALB/c小鼠36只，雌雄各半，體重16～20 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(湘)2016-0002；所有動物飼養(yǎng)均在海南省藥物安全性評價研究中心屏障設施內(nèi)，實驗動物使用許可證:SYXK(瓊)2016-0013，所用實驗動物均經(jīng)海南省藥物安評中心動物倫理委員會批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.1.2試劑 酶標板購自Jet Biofil公司；Goat Anti-Mouse IgG/HRP酶標二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；吐溫20(Tween20)購自Aladdin公司；PBS購自博士德生物工程公司；KLH購自Sigma公司；CD3-Percp、CD4-APC、CD8-PE、CD19-FITC抗體均購自美國BD公司；環(huán)磷酰胺購自德國Baxter Oncology Gmbh；HE染液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.1.3儀器 Multiskan FC型全波段酶標儀(Ther-mo Scientific賽默飛世爾科技)；BD Accuri C6 Flow Cytometer型流式細胞儀(BD biosciences公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及動物模型的建立 分組:BALB/c小鼠按體重隨機平均分為陰性對照組、平行對照組和環(huán)磷酰胺組；造模方法:平行對照組和環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺，給藥劑量40 mg/kg，陰性對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液，間隔 24 h追加給藥一次，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2KLH免疫方法[1]造模給藥后5 d(即第6天)，陰性對照和環(huán)磷酰胺組經(jīng)腹腔進行KLH免疫，免疫劑量為5 mg/kg，首次免疫后第7天加強免疫1次，平行對照組不予免疫；末次免疫后第8天，所有實驗動物采集EDTA-2K抗凝血和血清。

1.2.3小鼠TDAR實驗定量檢測方法 KLH包被濃度為80 μg/ml；待檢樣品血清的稀釋度為1∶400；Goat Anti-Mouse IgG/HRP酶標抗體的稀釋度為1∶16 000；每個待檢樣品均設復孔，實驗結(jié)果以OD值表示。

1.2.4小鼠TDAR實驗定性檢測方法 KLH包被濃度為20 μg/ml；待檢樣品血清的稀釋度為1∶5；Goat Anti-Mouse IgG/HRP酶標抗體的稀釋度為1∶16 000；每個待檢樣品均設復孔，定性結(jié)果的判定標準為當(樣品血清OD值-空白OD值) / (陰性血清OD值-空白OD值)>2.1，即認為是陽性。

1.2.5免疫細胞檢測方法 應用流式分析技術檢測外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞及CD3-CD19+B淋巴細胞百分比；分離脾臟，4%中性甲醛固定，常規(guī)HE染色。

1.3統(tǒng)計學分析 使用微軟Office Excel 2007和SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料組間比較采用單因素方差分析，定性結(jié)果分析采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組淋巴細胞亞群變化 流式細胞術檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照相比環(huán)磷酰胺對淋巴細胞具有明顯免疫抑制作用，能夠明顯降低外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞數(shù)量和CD3-CD19+B細胞數(shù)量(P<0.05)；同時平行對照組和環(huán)磷酰胺組之間CD3-CD19+B細胞數(shù)量具有明顯差異(P<0.05)，說明KLH能夠刺激外周血B淋巴細胞的增殖，見表1。

2.2各組實驗動物外周血清KLH IgG抗體產(chǎn)生情況 血清KLH IgG抗體定量分析結(jié)果顯示，與陰性對照相比，環(huán)磷酰胺能夠降低外周血KLH IgG抗體產(chǎn)生數(shù)量(P<0.05)，而定性分析結(jié)果(χ2檢驗)卻無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、3。

GroupsLymphocyte subsets(%)CD3+CD4+T cellCD3+CD8+T cellCD3-CD19+B cellControl46.55±3.9713.67±1.7333.86±5.28Parallel control 28.00±4.971)7.60±1.481)15.16±3.211)Cyclophosphamide31.97±7.731)9.56±1.671)19.40±1.411)2)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the parallel control group，2)P<0.05.

GroupsKLH IgG(OD)Control1.39±0.18Parallel control group 0.17±0.02Cyclophosphamide group 0.65±0.111)2)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the parallel control group，2)P<0.05.

表3 各組實驗動物外周血清KLH IgG抗體定性分析結(jié)果(n=12)

Tab.3 Results of KLH IgG in various groups(n=12)

GroupsKLH IgG+-Control120Parallel control group 012Cyclophosphamide group 111Total2313

圖1 各組脾臟病理組織學結(jié)果示例圖(×200)Fig.1 Histopathological results of spleen in each group(×200)Note: A.The lymphoid follicles and germinal centers in splenic corpuscles were formed,a small amount of B lymphocyte apoptosis was observed,and the cells in marginal zone increased;B.The cells were loosely arranged and there were a large number of necrotic cells in the splenic sinus;C.The cells were loosely arranged,and the lymphoid follicles and germinal centers in splenic corpuscles were slightly formed and marginal cells were slightly increased,and there were a large number of necrotic cells in the splenic sinus.

2.3各組脾臟病理組織學結(jié)果 脾臟組織病理組織學檢查結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺對脾臟有明顯毒性反應，可以使脾臟內(nèi)淋巴細胞數(shù)量減少，壞死細胞增多，邊緣區(qū)細胞數(shù)量減少；同時KLH能夠刺激脾小體內(nèi)生發(fā)中心的形成，見圖1。

3 討論

TDAR實驗是機體接觸特異性抗原后產(chǎn)生特異性抗體的過程，它涉及一系列免疫反應，包括B細胞、T細胞等多種免疫細胞的參與。該途徑出現(xiàn)任何問題均能導致特異性抗體生成障礙，因此該方法在藥物免疫毒理學研究中逐漸得到廣泛應用[2,3]。但受抗原標準化和檢測方法的限制，目前該方法在實際應用中也存在諸多問題。首要問題就是抗原的標準化，KLH是具有高度免疫原性的蛋白，比綿羊紅細胞(Sheep red blood cell,SRBC)更易獲得，性質(zhì)更穩(wěn)定，更適合作為標準化的T細胞依賴性抗原[4]。Lebrec和Peachee等[5,6]研究發(fā)現(xiàn)KLH作為抗原，比SRBC法變異性更小，結(jié)果更穩(wěn)定。其次在于特異性抗體的檢測手段，目前大多抗體檢測手段均為定性或半定量檢測，難以客觀準確地反映藥物對機體的免疫抑制作用，因此TDAR實驗如能進行定量分析，將能極大提高該方法的實用性。

本文通過KLH IgG抗體定性和定量兩種分析方法研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺能夠降低外周血清KLH 特異抗體產(chǎn)生量，與陰性對照組進行定量分析比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是定性分析差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明TDAR實驗定量分析方法能夠很好地反映環(huán)磷酰胺對機體的免疫抑制作用。同時如能結(jié)合淋巴細胞亞群和免疫組織器官組織學檢查，能夠更全面地評價藥物對免疫系統(tǒng)的抑制作用。例如本文研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺除了能夠明顯降低外周血清KLH IgG抗體產(chǎn)生量外，還能夠降低外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞及CD3-CD19+B淋巴細胞數(shù)量，同時對脾臟等組織器官也有明顯毒性反應，具有明顯免疫抑制作用。有文獻報道環(huán)磷酰胺能夠抑制免疫細胞增殖，尤其對B淋巴細胞，能夠通過減少B淋巴細胞而降低相應抗體的生成[7]。

通過上述研究發(fā)現(xiàn)以KLH為特異性抗原的TDAR定量分析方法能夠很好地預測藥物的免疫抑制作用，應用這種定量分析檢測方法，能夠提高TDAR實驗的靈敏性及實用性，特別是在評價一些腫瘤化療藥的免疫抑制程度、提高檢測藥物潛在免疫毒性的靈敏性上，具有重要應用價值。