張曉璇 朱 江 李佳佳 焦光美 單海雷 趙 亮 竇志杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，承德 067000)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke,CIS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要由腦內(nèi)動脈閉塞或破裂引起的急性腦血液循環(huán)障礙導(dǎo)致，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點[1]。隨著社會人口老年化的趨勢，近年來我國缺血性腦卒中的發(fā)病率不斷升高。缺血性腦卒中的發(fā)生由多因素導(dǎo)致，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前臨床主要通過溶栓劑和機械取栓治療[2,3]。近年來研究表明炎性反應(yīng)過程是缺血性腦卒中發(fā)生的主要原因，炎性因子在腦卒中病情進展及腦水腫形成中有著重要作用[4]。核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)，NF-κB可促進TNF-α、IL-6等細胞因子的表達，同時這些細胞因子又可進一步活化NF-κB，造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)[5]。丁苯酞臨床用于治療輕、中度急性缺血性腦卒中，具有抗神經(jīng)細胞凋亡作用，但對炎性反應(yīng)的影響研究甚少[6]。本實驗通過線栓法制備大腦中動脈栓塞，觀察丁苯酞對缺血性腦卒中大鼠腦組織NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達的影響，探討其對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用及其機制，為臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠50只，體重(220±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)，合格證號：SYXK(冀)2013-0023。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食、飲水。

1.1.2試劑 NF-κB p65單克隆抗體(Santa Cruz公司)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，國藥集團化學(xué)試劑有限公司的產(chǎn)品)；辣根過氧化物酶(HRP，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 將50只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丁苯酞低、中、高劑量組。丁苯酞低、中、高劑量組大鼠建模后分別灌胃給予劑量為20、40、60 mg/kg的丁苯酞，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.2模型的制備 除假手術(shù)組外，其余各組采用改良的大腦中動脈栓塞法(Zea Longa法)制備急性缺血性腦卒中模型[7]。腹腔注射7%水合氯醛麻醉大鼠，與頸部正中偏右切開皮膚，鈍性分離組織暴露右側(cè)頸總動脈，沿頸總動脈向遠心端分離頸內(nèi)、頸外動脈分叉稍后一段，在頸總動脈與頸外動脈下放置備用線，結(jié)扎頸總動脈近心端與頸外動脈，頸內(nèi)動脈用動脈夾夾閉。在距頸總動脈分叉約4 mm處剪小口，將MCAO尼龍線圓頭端栓線從小口插入，至微感阻力。結(jié)扎頸內(nèi)動脈，縫合，剪去栓線多余部分約留1 cm于皮外。假手術(shù)組操作同上，但只結(jié)扎頸總動脈與頸外動脈，不插栓線。

1.2.3神經(jīng)功能評分 采用Bederson等[8]建立的5分評分法對大鼠神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)癥狀；1分：提尾懸空時，大鼠對側(cè)前肢表現(xiàn)肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁；2分：大鼠置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動，阻力降低；3分：大鼠行走時向手術(shù)對側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈；4分：無自發(fā)活動行為。

1.2.4腦梗死體積的測定 處死大鼠后，立即于冰臺上取腦，置于-80℃保存，切成厚度相同的5片，采用0.1%TTC溶液于37℃避光孵育30 min，置于10%甲醛溶液固定24 h。缺血區(qū)域呈白色，正常區(qū)域呈紅色，測定腦梗死體積。梗死百分比(%)=白色區(qū)域重量/腦組織總重量×100%。

1.2.5Western blot檢測大鼠腦組織NF-κB p65表達水平 取大鼠腦組織50 mg，加入1 000 μl蛋白提取混合液，研磨制成勻漿，靜置裂解30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液，得到總蛋白提取液，取1 μl上清液，加入49 μl PBS混勻，于每孔加入20 μl，加入200 μl BCA試劑，37℃孵育20 min，酶標(biāo)儀570 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白的濃度。10%SDS-PAGE電泳分離，每孔蛋白上樣量30 μl，加入PBS，混勻，離心，95℃加熱變性5 min，起始電壓60 V，后用電壓100 V分離蛋白。恒定電流轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入5%脫脂牛奶于室溫封閉3 h，洗膜3次，每次10 min。加入NF-κB p65抗體作為一抗(1∶1 000)。4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫封閉 60 min，漂洗3次，每次10 min。采用Quantity One 定量分析軟件，對蛋白質(zhì)印跡進行灰度值測定；相對定量值=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.2.6免疫組織熒光法 取大鼠腦組織切片，采用梯度二甲苯脫蠟，微波爐低溫抗原修復(fù)20 min，4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次，采用0.25% Triton-X100 室溫通透30 min，PBS洗滌3次，加入正常山羊血清封閉20 min，加入一抗，4℃過夜，PBS洗滌3次，加入熒光素標(biāo)記的二抗，37℃包被1 h，加入細胞核染色液(DAPI)孵育5 min，PBS洗滌3次，加入熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7ELISA法測定腦組織IL-6、TNF-α水平 取大鼠缺血側(cè)腦組織，制成勻漿，于3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒方法測定IL-6和TNF-α含量，使用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IL-6和TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果 假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能癥狀，記分為0，其余大鼠均表現(xiàn)為左側(cè)不同程度的神經(jīng)功能癥狀。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丁苯酞低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著下降(P<0.05)；丁苯酞低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分隨著丁苯酞劑量增加呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腦梗死體積比較結(jié)果 假手術(shù)組大鼠均沒發(fā)現(xiàn)腦梗死，模型組大鼠腦梗死體積比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，丁苯酞低、中、高劑量組大鼠腦梗死體積比顯著下降(P<0.05)，見表2、圖1。

2.3各組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達水平結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、中、高劑量組大鼠NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；丁苯酞高劑量組NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于丁苯酞低、中劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

GroupsnScoreSham operation100Model82.62±0.311)Low dose101.80±0.222)Medium dose101.34±0.212)High dose101.01±0.122)

Note：Compared with sham operation,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

GroupsnVolume ratio of cerebral infarctionSham operation100Model817.43±2.031)Low dose1012.81±1.722)Medium dose1010.34±1.102)High dose107.26±1.492)

Note：Compared with sham operation,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

2.4各組大鼠腦組織NF-κB p65入核情況 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠NF-κB p65入核顯著增加。與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組大鼠NF-κB p65入核顯著減少；丁苯酞高劑量組NF-κB p65入核明顯低于丁苯酞低、中劑量組。見圖3。

2.5各組大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、中、高劑量組大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；丁苯酞高劑量組大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平明顯低于丁苯酞低、中劑量組，丁苯酞中劑量組大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平明顯低于丁苯酞低劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

圖1 大鼠腦組織TTC染色結(jié)果Fig.1 TTC staining results of brain tissue in ratsNote: A.Sham operation;B.Model;C.Low dose;D.Medium dose;E.High dose.

GroupsnNF-κB p65/β-actinSham operation100.37±0.03Model80.89±0.051)Low dose100.72±0.052)Medium dose100.66±0.042)High dose100.45±0.022)

Note：Compared with sham operation,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

圖2 各組大鼠腦組織 NF-κB p65蛋白表達水平Fig.2 Protein expression of NF-κB p65 among various groupsNote: 1.Sham operation;2.Model;3.Low dose;4.Medium dose;5.High dose.

圖3 各組大鼠NF-κB p65入核情況(×200)Fig.3 Nuclear displacement of NF-κB p65 among various groups(×200)Note: A.Sham operation;B.Model;C.Low dose;D.Medium dose;E.High dose.

GroupsnIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)Sham operation1072.03±5.81149.35±10.82Model8141.34±12.261)289.73±19.311)Low dose10124.94±11.302)226.51±20.212)Medium dose1095.31±10.342)193.53±15.802)High dose1081.44±10.832)180.24±13.992)

Note：Compared with sham operation,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

3 討論

缺血性腦卒中主要由于血腦微循環(huán)障礙引起神經(jīng)元損傷。腦組織缺血損傷可引起大量炎性細胞因子分泌，誘導(dǎo)細胞間黏附分子表達，增強白細胞與內(nèi)皮細胞表面的黏附，導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元凋亡[9]。

NF-κB信號通路的激活是炎性反應(yīng)的主要過程，大量研究表明，腦缺血過程中NF-κB信號通路被激活，誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞中炎性細胞因子的生成[10-12]。NF-κB是啟動、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，包括p65、p50、p52、p68、p75五個亞單位，其激活過程包括p65、p50核轉(zhuǎn)位[13]。IL-6是一種多能效的細胞因子，在機體免疫應(yīng)答、骨髓造血及炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。研究表明，腦缺血后腦內(nèi)表達IL-6增多，且在缺血再灌注后期仍維持在較高水平[14]。TNF-α主要提高機體免疫和促進組織愈合，是具有多效性作用的促炎性細胞因子，可促進腦缺血損傷區(qū)黏附分子的表達和炎性細胞的浸潤[15]。研究表明，TNF-α可通過促進血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，加重缺血性腦損傷[16]。

本研究結(jié)果表明低、中、高劑量的丁苯酞均能明顯降低缺血性腦卒中模型大鼠神經(jīng)功能評分，減少模型大鼠的腦梗死體積，對大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)起保護作用。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達與IL-6、TNF-α水平顯著升高，NF-κB p65入核明顯增加，說明缺血性腦卒中的發(fā)生可能由于NF-κB激活促進 IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌，IL-6、TNF-α水平升高導(dǎo)致炎癥過程的增強，進而激活單核細胞侵入腦血管內(nèi)膜形成泡沫細胞，誘發(fā)或加重腦卒中的發(fā)生。丁苯酞低、中、高劑量組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達與IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組，NF-κB p65入核明顯減少，說明丁苯酞可阻止NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB p65蛋白活化，調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，防止炎癥因子逆向持續(xù)活化NF-κB，從而減緩重缺血性腦卒中發(fā)展。綜上所述，丁苯酞可改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能、縮小腦梗死體積，其機制可能與抑制NF-κB的活化，抑制腦組織NF-κB p65蛋白表達，降低IL-6、TNF-α的水平有關(guān)。