劉 勇,趙遵江,張保德,章榮濤

(安徽省六安市人民醫(yī)院燒傷整形外科，安徽六安 237005)

糖尿病足是糖尿病常見并發(fā)癥之一，患者多表現(xiàn)為足部潰瘍、感染等反復(fù)發(fā)作。難愈性糖尿病足如果不及時治療易導(dǎo)致足部壞疽甚至截肢[1]，目前該病尚無特異性治療方法。重組人表皮生長因子(rh-EGF)能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)傷口愈合，是目前治療難愈性糖尿病足常用的藥物[2]。前列地爾在臨床常用于治療動脈閉塞癥等引起的四肢潰瘍等微小血管循環(huán)障礙性疾病，用于早期糖尿病足的治療也有報道，但前列地爾聯(lián)合rh-EGF治療難治性糖尿病足的報道較少。Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因子，通過檢測病變組織內(nèi)Bax和Bcl-2表達(dá)量的變化可以評估病灶細(xì)胞的凋亡，從而評估糖尿病足的病情[3]。因此，本研究考察了前列地爾聯(lián)合rh-EGF治療難愈性糖尿病足的臨床療效，并探討該療法的作用機制，報道如下。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 AZ100型400倍顯微鏡(日本尼康公司)；LOGIQ5型多普勒超聲儀(美國GE公司)；Bax、Bcl-2抗體(美國Abcam公司)；rh-EGF凝膠(桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司)；前列地爾注射液(規(guī)格：10 μg∶2 ml，西安力邦制藥有限公司)。

1.2 一般資料 選取安徽省六安市人民醫(yī)院2014年9月-2017年9月收治的110例難愈性糖尿病足患者作為研究對象，用隨機數(shù)字表法將患者分為觀察組和對照組，每組55例。研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國2型糖尿病防治指南(2013年版)》中糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)糖尿病足Wagner分級Ⅰ～Ⅲ級。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者足部壞死嚴(yán)重，需截肢治療；(2)糖尿病足Wagner分級Ⅳ級及以上；(3)患者有心、肺、腎等重要臟器功能障礙；(4)患者治療依從性差；(5)對本研究所用藥物過敏。

1.4 治療方案 對照組患者用rh-EGF凝膠進(jìn)行治療，用藥前以生理鹽水清潔創(chuàng)面，將rh-EGF凝膠涂抹于創(chuàng)面，用量為0.1 g/cm2，qd。觀察組患者在此基礎(chǔ)上聯(lián)合使用前列地爾，10 μg/次，qd，靜脈注射，治療時間均為2周。

1.5 觀察指標(biāo)和療效評價 分別于治療前、后采用多普勒超聲檢測患者的踝肱指數(shù)和雙側(cè)足背動脈血流速度等。根據(jù)患者治療后癥狀、臨床體征及糖尿病足Wagner評級結(jié)果評估臨床療效，將治療效果分為顯效、有效、無效。顯效：患者治療后足部的麻木、疼痛癥狀消失，足部潰瘍愈合，Wagner評級下降2級；有效：患者治療后足部的麻木、疼痛癥狀較治療前明顯緩解，潰瘍面積較治療前縮小50%以上，Wagner評級降低1級；無效：患者治療后癥狀無明顯變化甚至加重，Wagner評級較治療前無明顯改善。治療有效率=[(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)] ×100%。

1.6Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞率的檢測 分別于治療前、后取患者創(chuàng)面的肉芽組織，采用免疫組化法檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)。將肉芽組織進(jìn)行HE染色后，置400倍顯微鏡下觀察，其中胞漿、胞核均著棕色的是陽性細(xì)胞。每個樣品隨機選取5個視野，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/視野下所有細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 藥品不良反應(yīng)(ADRs)發(fā)生情況 記錄兩組患者治療期間發(fā)生的ADRs和藥物不良事件，計算ADRs發(fā)生率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料的比較 對兩組患者的一般資料做比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料的比較Table 1 Comparison of general information between the patients of the two groups (n=55)

2.2 兩組患者治療效果的比較 經(jīng)過2周的治療，對照組患者顯效12例，有效31例，無效12例，治療有效率78.2%；觀察組顯效18例，有效32例，無效5例，治療有效率90.9%。觀察組的治療有效率顯著高于對照組(P<0.001)。

2.3 踝肱指數(shù)和雙側(cè)足背動脈血流速度的比較 治療前，兩組患者的踝肱指數(shù)和雙側(cè)足背動脈血流速度無顯著性差異；治療后，兩組患者的踝肱指數(shù)和雙側(cè)足背動脈血流速度均較治療前顯著升高(P<0.05)，并且觀察組的踝肱指數(shù)和雙側(cè)足背動脈血流速度均較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

組別踝肱指數(shù)雙側(cè)足背動脈血流速度(v/m·s-1)Bcl-2陽性細(xì)胞率(%)Bax陽性細(xì)胞率(%)對照組 治療前0.46±0.070.19±0.083.16±1.1815.82±5.37 治療后0.57±0.07*0.29±0.07*5.38±2.97*13.27±4.65*觀察組 治療前0.47±0.060.18±0.073.14±1.2015.78±5.32 治療后0.65±0.06*△△△0.43±0.08*△△△6.57±3.12*△10.32±4.37*△△△

*P<0.05,與同組治療前比較；△P<0.05，△△△P<0.001,與同時期的對照組比較

2.4Bcl-2和Bax表達(dá)水平的比較 兩組患者糖尿病足創(chuàng)面組織HE染色顯微照片見圖1。由圖1可見，觀察組治療后創(chuàng)面組織可見典型新鮮肉芽組織，表現(xiàn)為大量的新生毛細(xì)血管形成，大量成纖維細(xì)胞浸潤，對照組創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞浸潤少，新鮮肉芽組織不明顯。兩組患者糖尿病足創(chuàng)面組織Bcl-2和Bax免疫組化染色顯微照片見圖2。治療前，兩組患者創(chuàng)面肉芽組織中Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞占比無顯著性差異(P>0.05)。治療后，兩組患者Bcl-2陽性細(xì)胞率均較治療前升高，觀察組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bax陽性細(xì)胞率均較治療前降低，觀察組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.5 ADRs 對照組有5例患者出現(xiàn)注射部位發(fā)紅，2例患者出現(xiàn)腹脹、腹瀉，ADRs發(fā)生率為12.7%(7/55)；觀察組有 6例患者出現(xiàn)注射部位發(fā)紅，3例患者出現(xiàn)輕度的腹脹、腹瀉，ADRs發(fā)生率為16.4%(9/55)。兩組患者的ADRs發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.846)。所有發(fā)生ADRs的患者經(jīng)對癥治療后均明顯緩解，未影響治療。

圖1 兩組患者糖尿病足創(chuàng)面組織HE染色顯微照片(×400)Figure 1 HE staining micrographs of diabetic foot wound tissues in the two groups(×400)A：觀察組治療前；B：觀察組治療后；C：對照組治療前；D：對照組治療后

圖2 兩組患者糖尿病足創(chuàng)面組織Bcl-2和Bax免疫組化染色顯微照片(×400)Figure 2 Immunohistochemical staining micrographs of Bcl-2 and Bax of diabetic foot wound tissues in the two groups(×400)A:對照組治療前的Bcl-2;B:對照組治療后的Bcl-2;C:觀察組治療前的Bcl-2;D:觀察組治療后的Bcl-2;E:對照組治療前的Bax;F:對照組治療后的Bax;G:觀察組治療前的Bax;H:觀察組治療后的Bax

3 討 論

糖尿病患者由于糖代謝紊亂，血糖升高，會發(fā)生外周血管內(nèi)皮增厚、血管內(nèi)皮活性降低等改變，因此糖尿病患者的下肢血液供應(yīng)障礙，糖尿病足難以愈合[5]。此外，糖尿病患者由于外周神經(jīng)病變，痛覺和溫度敏感性降低，因此創(chuàng)面受傷后不易發(fā)覺，容易受到二次損傷或多次損傷，使創(chuàng)面更加難以愈合[6]。表皮生長因子在創(chuàng)面修復(fù)過程中有重要作用，能夠促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖[7]。本研究的對照組患者僅采用rh-EGF治療，治療后部分患者癥狀明顯改善，表明外用rh-EGF具有一定療效。前列地爾是一種血管擴(kuò)張劑，能夠促進(jìn)四肢、心、腦等部位微小血管擴(kuò)張，改善微循環(huán)[8]，此外還有抑制血小板聚集、提高紅細(xì)胞變形能力、增加微血管供血的功能[9]。觀察組患者采用前列地爾聯(lián)合rh-EGF治療，治療效果明顯優(yōu)于對照組，表明前列地爾與rh-EGF具有協(xié)同作用，能夠增強治療效果。

Bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的基因，具有抗氧化、抑制鈣離子跨膜運動等作用，可有效抑制細(xì)胞凋亡。Bax是Bcl-2基因家族成員，是細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bax過度表達(dá)會引起線粒體功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。Bax表達(dá)量增多促使其自身寡聚化，形成Bax寡聚體。Bax寡聚體與Bcl-2結(jié)合，抵抗其抑制凋亡的作用，并且寡聚化的Bax能夠穿透線粒體膜進(jìn)入線粒體，促進(jìn)線粒體凋亡，從而引起細(xì)胞凋亡。糖尿病足患者的Bax表達(dá)上調(diào)會引起潰瘍部位表皮細(xì)胞線粒體功能障礙，抑制上皮細(xì)胞分裂，因此檢測Bcl-2和Bax在糖尿病足潰瘍部位的表達(dá)量能夠評估上皮細(xì)胞的生長狀態(tài)[11]。本研究中，兩組患者治療后均出現(xiàn)Bcl-2上調(diào)、Bax下調(diào)，表明Bcl-2上調(diào)及Bax下調(diào)有利于糖尿病足創(chuàng)面的愈合。觀察組患者的Bcl-2表達(dá)高于對照組，Bax表達(dá)低于對照組，分析原因可能是表皮生長因子能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的有絲分裂，增強細(xì)胞活力，但是由于糖尿病足患者微血管壁增厚，血液循環(huán)受阻，因此上皮細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)不良，rh-EGF作用受限。rh-EGF聯(lián)用前列地爾后，病變部位血供良好，能夠保證上皮細(xì)胞充足的營養(yǎng)，因此促進(jìn)上皮細(xì)胞生長。前列地爾聯(lián)合rh-EGF，通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面愈合。此外，本研究還對治療安全性進(jìn)行了評估，兩組患者均出現(xiàn)輕微ADRs，經(jīng)對癥治療后，ADRs明顯好轉(zhuǎn)，表明前列地爾聯(lián)合rh-EGF治療糖尿病足的安全性較高，值得在難治性糖尿病足的治療中推廣。