李程，Nora Renz，Andrej Trampuz

(Charité-Universit?tsmedizin Berlin，Center for Musculoskeletal Surgery，Berlin，Germany 14059)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是一種有效、常用的骨科手術(shù)技術(shù)，能夠改善關(guān)節(jié)功能，提高患者的生活質(zhì)量。假體周圍感染是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥。雖然發(fā)生率很低，在膝、肩關(guān)節(jié)置換術(shù)后的發(fā)生率<1%，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生率<2%[1]，但是一旦發(fā)生感染給患者帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。一份來(lái)自發(fā)展中國(guó)家的報(bào)告顯示[2]，假體周圍感染患者的治療費(fèi)用可以比普通住院患者費(fèi)用高24倍。早期明確診斷感染，對(duì)后續(xù)的手術(shù)治療起著關(guān)鍵的作用[1]。超聲裂解作為一種術(shù)中診斷假體周圍感染的方法有著較高的準(zhǔn)確性。尤其是對(duì)于樣本采集前接受抗生素治療的患者。1998年，Tunney等[3]首次報(bào)道了超聲裂解在髖關(guān)節(jié)假體周圍感染診斷中的應(yīng)用，但由于受到操作方法等影響，并沒(méi)有體現(xiàn)出這種培養(yǎng)方法的價(jià)值。2007年，Trampuz等[4]對(duì)此方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)果顯示無(wú)論患者是否術(shù)前接受抗生素治療，超聲裂解液的敏感度均優(yōu)于術(shù)中假體周圍組織培養(yǎng)獲得的結(jié)果。由于超聲裂解法操作簡(jiǎn)單，而且有著較好的敏感度，這種方法逐漸應(yīng)用于假體周圍感染的診斷。近年來(lái)，除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)之外，還出現(xiàn)了一些能提高診斷準(zhǔn)確性的新方法，如血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、分子生物學(xué)技術(shù)、微量熱法等[5-8]。我們對(duì)超聲裂解法的操作步驟以及一些新的培養(yǎng)方法進(jìn)行分析，為臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

1 假體周圍感染的診斷方法

目前，有關(guān)假體周圍感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)還缺乏共識(shí)。肌肉骨骼感染協(xié)會(huì)(musculoskeletal infection society，MSIS)、美國(guó)感染協(xié)會(huì)(infectious diseases society of America，IDSA)、歐洲骨與關(guān)節(jié)感染協(xié)會(huì)(European bone and joint infection society，EBJIS)相繼提出了一些協(xié)助診斷假體周圍感染的指南[9-11]。在歐洲，常用的診斷假體周圍感染的指南為EBJIS提出的方法。根據(jù)EBJIS的診斷方法，如果滿足以下≥1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可診斷為假體周圍感染：a)臨床表現(xiàn)：竇道或瘺管形成，假體周圍可見(jiàn)膿液(注：關(guān)節(jié)假體金屬對(duì)金屬界面可出現(xiàn)類似膿液的表現(xiàn)，但是白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，所見(jiàn)到的為金屬碎屑)。b)組織學(xué)：每10個(gè)高倍視野下，發(fā)現(xiàn)≥23個(gè)粒細(xì)胞，Krenn和Morawietz分型之后的2或3型，相當(dāng)于假體周圍感染。c)關(guān)節(jié)腔穿刺細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞>2 000/μL或中性粒細(xì)胞>70%。(在術(shù)后6周內(nèi)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病、假體周圍骨折或脫位的患者可出現(xiàn)白細(xì)胞升高而非感染。所獲得的穿刺液標(biāo)本需要在24 h內(nèi)通過(guò)顯微鏡或細(xì)胞計(jì)數(shù)器，檢測(cè)出白細(xì)胞數(shù)目)。d)微生物學(xué)：關(guān)節(jié)腔穿刺液培養(yǎng)陽(yáng)性，或至少有2份組織樣本培養(yǎng)出同一種細(xì)菌(對(duì)于金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等具有高度傳染性的微生物，或患者正在接受抗生素治療，只要一個(gè)組織樣本被檢測(cè)出陽(yáng)性，即可診斷為假體周圍感染)，或超聲裂解液≥ 50 CFU/mL(當(dāng)細(xì)菌為金黃色葡萄球菌或者厭氧菌，并且正在使用抗生素時(shí)，即使<50 CFU/mL也可認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果)。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，使用EBJIS指南診斷假體周圍感染時(shí)，能夠比MSIS、IDSA指南發(fā)現(xiàn)更多假體周圍感染的病例。

2 假體超聲裂解

目前，超聲裂解法的操作方法還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究把Trampuz[4]使用的方法作為標(biāo)準(zhǔn)。首先，在手術(shù)中取出懷疑感染的假體關(guān)節(jié)，將假體關(guān)節(jié)放入合適的容器內(nèi)。然后加入超聲裂解處理液進(jìn)行漩渦振蕩30 s，振蕩后放入超聲清洗器中清洗5 min。清洗后再次漩渦振蕩30 s，最后將獲取的超聲裂解液移入培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)(見(jiàn)圖1)。

注： 1-避免污染，最好使用合適的無(wú)菌手術(shù)器械把假體裝入容器；2-必須選用無(wú)菌、結(jié)實(shí)、密封性好、大小合適的容器；3-振蕩可選用手動(dòng)或置于漩渦振蕩器上

通過(guò)閱讀文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)部分超聲裂解法的操作步驟為超聲裂解后離心[13]或超聲裂解結(jié)合漩渦振蕩[14-16]。然而，加入漩渦振蕩或者離心是否對(duì)培養(yǎng)結(jié)果造成影響。Zitron等[17]對(duì)35例骨科翻修手術(shù)中移除的假體采用兩組培養(yǎng)方法進(jìn)行對(duì)比研究。一組為振蕩、超聲裂解加離心，另一組為振蕩、超聲裂解加膜濾法。結(jié)果顯示離心組的敏感度明顯高于膜濾組(78.8% vs 30.3%；P<0.001)。離心法可能會(huì)提高培養(yǎng)結(jié)果的敏感度。

Portillo等[18]為了發(fā)現(xiàn)振蕩在診斷假體周圍感染時(shí)是否有效，對(duì)135例關(guān)節(jié)翻修手術(shù)中移除的假體分為振蕩結(jié)合超聲裂解、振蕩法兩組進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果顯示有35例患者被診斷為假體周圍感染(急性14例，慢性21例)。當(dāng)cutoff≥1 CFU/mL時(shí)，振蕩結(jié)合超聲裂解的敏感度為71%[95% CI(54%～85%)]、特異度為93%[95% CI(86%～97%)]。振蕩法的敏感度為69%[95% CI(51%～83%)]、特異度為92%[95% CI(85%～96%)]。當(dāng)cutoff≥50 CFU/mL時(shí)，振蕩結(jié)合超聲裂解的敏感度為60%[95% CI(42%～76%)]、特異度為99%[95% CI(95%～100%)]。振蕩法的敏感度為40%[95% CI(24%～58%)]、特異度為99%[95% CI(95%～100%)]。在接受抗生素治療與沒(méi)有接受抗生素治療的分組中，不同cutoff以及急、慢性感染顯示出不同的結(jié)果(見(jiàn)圖2)。當(dāng)cutoff≥1 CFU/mL(沒(méi)有接受抗生素治療的病例)或cutoff≥50 CFU/mL(接受抗生素的急性感染病例)時(shí)，振蕩結(jié)合超聲裂解與單純振蕩有相同的敏感度。除此之外，振蕩結(jié)合超聲裂解的敏感度均優(yōu)于振蕩法。雖然振蕩結(jié)合超聲裂解的方法優(yōu)于單純振蕩，但是以≥1 CFU/mL為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于沒(méi)有接受抗生素治療的患者，也許是一種可行的培養(yǎng)方法。特別是對(duì)于一些沒(méi)有超聲清洗器的醫(yī)院，把移除的假體放入無(wú)菌、密封的塑料容器內(nèi)，加入超聲裂解處理液。然后可進(jìn)行手動(dòng)振蕩或置于漩渦振蕩器上。最后，對(duì)獲取的液體進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)。

a cutoff≥ 50 CFU/mL時(shí)的敏感度 b cutoff≥1 CFU/mL時(shí)的敏感度

c cutoff≥50 CFU/mL時(shí)急性感染的敏感度 d cutoff≥50 CFU/mL時(shí)慢性感染的敏感度

圖2 接受抗生素治療對(duì)振蕩加超聲裂解、振蕩法的敏感度的影響

圖3 術(shù)中組織、超聲裂解液培養(yǎng)出的表皮葡萄球菌，超聲裂解液檢測(cè)到比假體周圍組織多10 000倍的微生物

3 超聲裂解液的培養(yǎng)方法

組織培養(yǎng)和超聲裂解法是術(shù)中診斷假體周圍感染常用的兩種方法，在診斷體周圍感染時(shí)，超聲裂解通常比組織培養(yǎng)法檢測(cè)出更多的微生物[19](見(jiàn)圖3)。

有研究發(fā)現(xiàn)，超聲裂解法的敏感度優(yōu)于術(shù)中組織培養(yǎng)。超聲裂解法與術(shù)中組織培養(yǎng)在髖、膝關(guān)節(jié)感染的敏感度分別為92.6%、66.7%；肩關(guān)節(jié)感染的敏感度分別為66.7%、54.5%；肘關(guān)節(jié)感染的敏感度分別為89%、55%[20-22]。Prieto-Borja等[23]發(fā)現(xiàn)雖然超聲裂解液的總體敏感度和特異度優(yōu)于組織培養(yǎng)、關(guān)節(jié)腔穿刺液培養(yǎng)。但是對(duì)于早期感染(術(shù)后3個(gè)月內(nèi))，超聲裂解法較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。在延遲感染(術(shù)后3～24個(gè)月)的病例中，術(shù)中組織與關(guān)節(jié)腔穿刺液培養(yǎng)的基礎(chǔ)上結(jié)合超聲裂解培養(yǎng)，診斷的敏感度提升了26.6%。由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法有一定的局限性，檢測(cè)病原菌的敏感度并不高，大約39%～70%之間[24]。雖然超聲裂解液在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)有較好的敏感度和特異度(見(jiàn)表2)。但為了進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確性，近年一些與超聲裂解液相組合的方法，開(kāi)始逐漸用于臨床診斷假體周圍感染。

表2 超聲裂解液在普通培養(yǎng)基中的敏感度和特異度比較

3.1 血培養(yǎng)瓶法 把樣本接種在血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)的方法，早期應(yīng)用于關(guān)節(jié)腔穿刺液培養(yǎng)[26]。然而目前有關(guān)超聲裂解液接種到血培養(yǎng)瓶的研究較少。Shen等[27]對(duì)110例懷疑感染的病例的超聲裂解液、關(guān)節(jié)腔穿刺液分別接種到血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行對(duì)比，超聲裂解液診斷假體周圍感染的敏感度為88%[95% CI(76%～95%)]、特異度為87%[95% CI(75%～94%)]。關(guān)節(jié)腔穿刺液的敏感度為64%[95% CI(49%～77%)]、特異度為98%[95% CI(91%～100%)]。超聲裂解液的敏感度比關(guān)節(jié)腔穿刺液高，但是特異度低于關(guān)節(jié)腔穿刺液。在接受抗生素治療的病例中，超聲裂解液培養(yǎng)結(jié)果優(yōu)于關(guān)節(jié)腔穿刺液(17例對(duì)比11例)。Portillo等[5]對(duì)75例懷疑感染的骨科內(nèi)植物分別進(jìn)行超聲裂解液培養(yǎng)基培養(yǎng)與血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。在39例感染中，多數(shù)患者在標(biāo)本采集前14d內(nèi)接受了抗生素治療，然而結(jié)果顯示血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)出更高的敏感度(100%對(duì)比87%)。Janz等人[28]發(fā)現(xiàn)超聲裂解液血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)不僅能夠比傳統(tǒng)培養(yǎng)方式檢測(cè)出更多陽(yáng)性的結(jié)果(101例對(duì)比51例)、培養(yǎng)時(shí)間更短(2.9 d對(duì)比4.2 d)。而且這種在全自動(dòng)血培養(yǎng)儀培養(yǎng)的方式，減少實(shí)驗(yàn)人員60.1%的平均工作時(shí)間[29]。為了提高診斷的準(zhǔn)確性，減少假陽(yáng)性的發(fā)生。在超聲裂解液接種到血培養(yǎng)瓶的過(guò)程中，注意避免污染。

3.2 分子生物學(xué)技術(shù) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR和多重PCR逐漸被用于假體周圍感染的診斷。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于培養(yǎng)時(shí)間短(<5 h)、自動(dòng)化、不易受抗生素影響、敏感度和特異度較高、易于區(qū)分無(wú)菌性松動(dòng)和假體周圍感染等[8，30]。與傳統(tǒng)超聲裂解法相比，超聲裂解液PCR的敏感度更高(77.1%對(duì)比72.9%)[25]。Liu等[6]對(duì)超聲裂解液PCR在假體周圍感染中的診斷進(jìn)行meta分析，通過(guò)篩選共納入9篇文獻(xiàn)，其敏感度為75%[95% CI(71%～79%)]，特異度為96%[95% CI(94%～97%)]。該研究發(fā)現(xiàn)新鮮標(biāo)本的敏感度優(yōu)于冰凍保存標(biāo)本(82%對(duì)比70%)，多重PCR比PCR有更高的特異度(98%對(duì)比94%)。這種方法由于花費(fèi)高，并沒(méi)有在臨床普遍應(yīng)用。

3.3 微量熱法 微量熱法是利用微生物生長(zhǎng)和代謝時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)快速檢測(cè)到細(xì)菌，這種方法由于敏感度高、方便準(zhǔn)確，常被用于生物工程技術(shù)、藥理學(xué)等方面。在臨床上常用于篩查輸血袋是否有細(xì)菌生長(zhǎng)[31]。2013年Borens等[7]首次發(fā)表了微熱量法診斷骨科內(nèi)植物感染的臨床研究，結(jié)果顯示超聲裂解液微熱量法的敏感度為100%、特異度為97%。這種方法能夠在24h內(nèi)完成細(xì)菌培養(yǎng)。目前微熱量法在假體周圍感染的應(yīng)用較少，還需要更多的臨床研究來(lái)驗(yàn)證其診斷價(jià)值。

4 超聲裂解法的機(jī)制

在所有人類感染中，有超過(guò)65%的感染與生物膜相關(guān)。由于骨科內(nèi)植物假體材料的易感性，所以很容易引起生物膜相關(guān)感染。生物膜是復(fù)雜的微生物群落以嵌入胞外多糖的形式附著于假體表面。生物膜在假體表面形成可以分為四步：黏附、增殖、生物膜成熟和擴(kuò)散。其中微生物黏附于假體表面是生物膜形成的第一步，也是最重要的一步[32]，微生物可通過(guò)三種途徑黏附于假體表面后發(fā)生感染[33]：a)手術(shù)期間通過(guò)手術(shù)切口傳播；b)尿路感染或皮膚感染等通過(guò)血源性或淋巴源性傳播。只要假體(異物)存在，就可發(fā)生于關(guān)節(jié)置換術(shù)后的任何時(shí)期；c)通過(guò)相鄰組織傳播(感染的軟組織、骨髓炎等)。超聲裂解在低頻率、低強(qiáng)度的作用下，通過(guò)破壞和分離假體表面的生物膜(不影響微生物活性)，從而發(fā)現(xiàn)更多的微生物[34]。

目前，假體周圍感染的診斷仍面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雖然超聲裂解法表現(xiàn)出較高的敏感度和特異度。但是，即使超聲裂解法培養(yǎng)出陽(yáng)性結(jié)果，也要警惕可能是污染造成的假陽(yáng)性。建議在診斷假體周圍感染時(shí)，采用多種培養(yǎng)方法相結(jié)合進(jìn)行綜合評(píng)估。在醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室條件允許的情況下，使用血培養(yǎng)瓶法、分子生物學(xué)技術(shù)、微熱量法等能夠提高診斷的準(zhǔn)確性。