尹希燕 孫麗 劉子忠 劉偉 宋加利 劉旋

(濱州市第二人民醫(yī)院 1老年醫(yī)學科，山東 濱州 256800；2心內(nèi)科；3心血管外科)

沙利度胺(thalidomide)又稱反應停，研究發(fā)現(xiàn)其在一些進展性、難治性實體瘤和骨髓瘤的治療中具有抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用可能與抑制腫瘤血管生成有關〔1,2〕。同源異型結構域蛋白轉(zhuǎn)化生長影響因子(TGIF)家族由 TGIF、TGIF2、TGIFLX和 TGIFLY組成〔3〕。TGIF2是TGIF家族中的重要成員，其在高糖作用下，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中TGIF2低表達，在血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用，上調(diào) TGIF2 表達后，對高糖引起的血管內(nèi)皮損傷有一定的改善作用〔4,5〕。miRNA在機體多種生理病理過程中的作用已得到普遍認可，包括調(diào)節(jié)血管生成〔6,7〕，如miR-34a能夠通過下調(diào)TGIF2表達抑制HUVECs的增殖和遷移能力，促進其凋亡，從而促進血管內(nèi)皮損傷〔8〕。但miR-29c-3p在血管生成中的作用及機制尚未清楚。本研究擬以HUVECs為研究對象，檢測沙利度胺處理的HUVECs中miR-29c-3p、TGIF2的表達，觀察過表達miR-29c-3p、抑制miR-29c-3p、過表達TGIF2、敲減TGIF2對沙利度胺處理的HUVECs增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs購自美國Lonza公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細胞培養(yǎng) 用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 將miR-29c-3p mimics、miR-NC、20 μg/ml沙利度胺+anti-miR-29c-3p、20μg/ml沙利度胺+anti-miR-NC、si-con、si-TGIF2、20 μg/ml沙利度胺+pcDNA、20 μg/ml沙利度胺+pcDNA-TGIF2按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書操作步驟轉(zhuǎn)染至HUVECs，然后用20 μg/ml沙利度胺處理48 h，分別標記為miR-29c-3p mimics組、miR-NC組、沙利度胺+anti-miR-29c-3p組、沙利度胺+anti-miR-NC組、si-con組、si-TGIF2組、沙利度胺+pcDNA組、沙利度胺+pcDNA-TGIF2組，轉(zhuǎn)染48 h后，用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗。

1.4qRT-PCR實驗 取適量對數(shù)生長期1.3中各組細胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書提取RNA，進行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書進行miR-29c-3p、TGIF2檢測。用2-△△Ct計算miR-29c-3p、TGIF2的表達。

1.5MTT實驗 取適量1.3各組細胞，加入20 μl、5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的增殖力與細胞活力呈正比。

1.6Annexin V-FITC/PI流式細胞術 將1.3各轉(zhuǎn)染組細胞用結合緩沖液 500 μl懸浮細胞，分別加入5 μl Annexin V-/FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細胞儀測定結果。細胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.7Western印跡實驗 收集1.3各組細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5倍SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗 取適量對數(shù)生長期1.3各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，以psiCHECK2-TGIF2-3'UTR WT和psiCHECK2-TGIF2-3'UTR MUT的表達為對照，觀察miR-29c-3p對TGIF2表達的影響。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞miR-29c-3p表達、細胞增殖和凋亡的影響 與對照組相比，沙利度胺組miR-29c-3p表達顯著升高，48、72 h細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 細胞凋亡流式圖

表1 沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞miR-29c-3p表達、細胞增殖和凋亡的影響

2.2過表達miR-29c-3p對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-29c-3p組miR-29c-3p表達顯著升高，48、72 h細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 過表達miR-29c-3p對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

2.3抑制miR-29c-3p表達沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響 與沙利度胺+anti-miR-NC組相比，沙利度胺+anti-miR-29c-3p組miR-29c-3p表達顯著降低，48、72 h細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見表3。

表3 抑制miR-29c-3p表達沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

2.4miR-29c-3p靶向調(diào)控TGIF2表達 運用miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-29c-3p與TGIF23'UTR存在結合位點(圖2)；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組(1.04±0.09)相比，miR-29c-3p組WT-TGIF2細胞中熒光活性(0.43±0.05)顯著降低(t=10.262,P=0.001)，WT-TGIF2細胞中熒光活性不受影響，兩組MUT-TGIF2(1.01±0.08、0.97±0.08)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.612,P=0.573)；與miR-NC組(0.61±0.06)相比，miR-29c-3p組細胞中TGIF2表達(0.24±0.03)顯著降低，與anti-miR-NC組(0.54±0.05)相比，anti-miR-29c-3p組(0.97±0.09)顯著升高(均P<0.05)，且4組差異有統(tǒng)計學意義(F=71.470,P=0.000)，見圖3。

圖2 TGIF2的3'UTR中含有與miR-29c-3p互補的核苷酸序列

圖3 TGIF2蛋白表達

2.5沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞中TGIF2表達的影響 與對照組(1.15±0.08、0.64±0.06)相比，沙利度胺組TGIF2 mRNA表達(0.47±0.05)顯著降低(t=12.485,P=0.000)，TGIF2蛋白表達(0.31±0.02)顯著降低(t=9.037,P=0.001)。見圖3。

2.6敲減TGIF2表達對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-TGIF2組TGIF2蛋白表達顯著降低(圖3)，48、72 h細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。見表4。

2.7TGIF2過表達沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響 與沙利度胺+pcDNA組相比，沙利度胺+pcDNA-TGIF2組TGIF2蛋白表達顯著升高，48、72 h細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖3，表5。

表4 敲減TGIF2表達對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

表5 過表達TGIF2沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

大量研究證實，沙利度胺為血管生成的抑制劑，但其抗血管生成作用的機制尚未清楚〔9,10〕。Bauer等〔11〕報道，沙利度胺抑制大鼠主動脈的微血管形成，但在沒有微粒體的情況下，沙利度胺對微血管形成或細胞增殖沒有影響，證明沙利度胺的代謝物是其抗血管生成作用的原因。遲曉艷等〔12〕在血管內(nèi)皮細胞的研究中報道，沙利度胺可抑制其增殖，促進凋亡并阻滯G0/G1期以抑制腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可抑制HUVECs增殖，促進凋亡；進一步研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可上調(diào)HUVECs中miR-29c-3p的表達。

研究顯示，miRNA參與真核生物的病理生理過程，包括血管內(nèi)皮的生成〔13〕及與血管相關疾病的進展〔14〕。Wang等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-126能降低棕櫚酸誘導的HUVEC中活性氧(ROS)的產(chǎn)生、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達和細胞凋亡，抑制miR-126則起到相反的作用，miR-126通過位于TNF(TRAF)7 mRNA的3'非翻譯區(qū)的靶向作用抑制TRAF7表達，提示miR-126在HUVEC中具有抗細胞凋亡的作用。胡赟〔16〕報道，過表達miR-29c可抑制人血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成，其機制與miR-29c靶向胰島素樣生長因子(IDF)-1抑制IDF-1及IDF-1/磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路下游的相關基因表達，從而參與調(diào)節(jié)血管的生成。本研究結果與胡赟〔16〕的研究結果相吻合；進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29c-3p可逆轉(zhuǎn)沙利度胺對HUVECs的增殖抑制和凋亡促進作用；雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證，miR-29c-3p靶向負調(diào)控TGIF2。

TGIF2為TGIF家族中的關鍵成員，其參與組織分化、代謝及腫瘤生成〔17,18〕。何淑珍等〔19〕建立高糖誘導的HUVECs細胞，通過MTT、RT-PCR、Western、transwell、流式細胞術研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的HUVECs可抑制TGIF2表達、細胞的增殖和遷移能力，促進凋亡，過表達TGIF2可促進細胞增殖和遷移，抑制凋亡，揭示了TGIF2在血管內(nèi)皮細胞生長中的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減TGIF2可抑制HUVECs增殖，促進凋亡；進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達TGIF2可逆轉(zhuǎn)沙利度胺對血管內(nèi)皮細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

綜上，沙利度胺可抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，促進凋亡，其機制可能與調(diào)控miR-29c-3p/TGIF2信號通路有關，為沙利度胺的廣泛臨床應用奠定基礎。