周彥邑 張旭東，2 蔣雯雯 韋登明

(1寧波大學醫(yī)學院病理學系，浙江 寧波 315211；2湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心)

類風濕關節(jié)炎(RA)，是一種以侵蝕性關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病，涉及免疫系統(tǒng)中的多種細胞因子、酶等〔1〕，引起關節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并可出現(xiàn)關節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終可導致關節(jié)畸形和功能喪失。RA關節(jié)軟骨損傷目前尚無理想的治療方法，傳統(tǒng)的治療可通過自體軟骨移植(如利用自體骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為軟骨細胞〔2〕)和同種異體軟骨移植進行軟骨缺損治療，但各有局限。支架材料、種子細胞和細胞生長因子的組織工程技術為關節(jié)軟骨缺損修復開辟了新道路，在臨床應用上取得顯著效果〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞和Treg細胞間的平衡失調(diào)可能與RA的發(fā)生有著重要關系〔5，6〕。研究表明〔7〕，利用海藻酸鈉支架復合組織工程化軟骨細胞對佐劑性關節(jié)炎(AA)導致的軟骨缺損有一定的療效，能夠減輕局部炎性反應，但抗炎機制尚不清楚。本研究觀察海藻酸鈉支架復合軟骨細胞對AA兔關節(jié)滑膜Th17和Treg細胞相關細胞因子白細胞介素(IL)-10、IL-22及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2月齡雄性新西蘭兔40只，清潔級，體重2～3 kg，購自浙江省余姚泗門鎮(zhèn)建飛實驗兔養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK(浙)2012-0050。適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分成正常組、模型組、支架組、軟骨細胞組、支架復合軟骨細胞組各8只。

1.2試劑 烏拉坦、Percoll細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)，完全弗氏佐劑(FAC)、海藻酸鈉粉劑(美國Sigma公司)，胎牛血清、RPMI1640型培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，胰蛋白酶、阿利新藍(上海生工生物工程有限公司)，兔抗IL-10多克隆抗體、兔抗IL-22多克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，Bio-Swamp兔IL-10、IL-22、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)，鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3儀器 光學顯微鏡(CX40，日本Olympus公司)、臺式超高速低溫離心機(Centrifuge 5810R，德國Eppendorf公司)、超凈工作臺(C1-9，上海江龍儀表電子有限公司)、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(3111，美國Thermo Fisher Scientific公司)、包埋機(BM-Ⅶ，宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)、石蠟切片機(HM-325，德國LEICA公司)。

1.4AA兔模型制備 10%烏拉坦按3 ml/kg劑量對兔耳緣靜脈進行注射麻醉，觀察兔睫毛反射，待反射消失，向模型組和各治療組兔右膝關節(jié)內(nèi)分別注射0.5 ml FCA，2 w后再次注射，正常組注射等量生理鹽水。21 d后觀察到注射FCA的兔右膝關節(jié)局部出現(xiàn)紅腫，且較正常組明顯腫大，標志造模成功。

1.5兔自體骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為軟骨細胞 抽取軟骨細胞組和支架復合軟骨細胞組兔骨髓，自體骨髓間充質(zhì)干細胞的提取，分離、培養(yǎng)、誘導分化與鑒定等各步操作參照文獻〔8〕。

1.6回注治療 骨髓間充質(zhì)干細胞成功誘導為軟骨細胞后，向支架組兔膝關節(jié)注射0.50 ml海藻酸鹽支架；軟骨細胞組注射0.50 ml軟骨細胞懸液；支架復合軟骨細胞組注射0.25 ml海藻酸鹽支架和0.25 ml軟骨細胞懸液的混合物；模型組和正常組注射0.50 ml生理鹽水，治療1個月。

1.7兔膝關節(jié)組織病理學檢查

1.7.1兔膝關節(jié)滑膜蘇木素-伊紅(HE)染色 治療結(jié)束后處死所有兔子，取各組膝關節(jié)，中性甲醛固定液固定，用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液進行脫鈣4 w，取材，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片制作石蠟切片標本，HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下鏡檢。

1.7.2膝關節(jié)滑膜免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min；0.01 mol/L枸櫞酸修復液微波抗原修復6 min，沸騰后室溫放置10 min，重復2次，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min；5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉20 min，甩掉封閉液，勿洗；組織標本在濕盒中分別滴加IL-10、IL-22、TGF-β1一抗工作液，4℃冰箱過夜；37℃恒溫箱1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶重合物(SABC)工作液，37℃恒溫箱30 min，PBS沖洗4次，每次5 min，雙蒸水洗1次；滴加DAB顯色劑，鏡下觀察適時終止顯色，雙蒸水洗1次，蘇木素輕度復染3 min，流水沖洗后溫水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。隨機選取切片各5張，在400倍鏡下各隨機選取4個視野用JD801形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定各指標陽性產(chǎn)物的積分光密度(OD)。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兔膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 造模21 d后，正常組兔膝關節(jié)觸摸堅硬無紅腫；而模型組明顯紅腫。治療結(jié)束后，正常組兔膝關節(jié)軟骨表面光滑，呈透明狀，關節(jié)腔內(nèi)無積液，周圍沒有出現(xiàn)組織增生的現(xiàn)象；模型組可見關節(jié)軟骨呈凹陷缺損，呈乳白色，關節(jié)腔內(nèi)可見大量積液，周圍組織增生現(xiàn)象嚴重，甚至出現(xiàn)關節(jié)畸形現(xiàn)象；各治療組表面光滑呈半透明狀，關節(jié)軟骨缺損部分有所改善，沒有明顯增厚的乳白色組織，但仍可見被侵蝕的痕跡。

2.2兔膝關節(jié)滑膜HE染色結(jié)果 正常組關節(jié)滑膜未見炎性細胞浸潤，模型組炎性細胞浸潤嚴重，各治療組較模型組炎性反應均有所減輕。軟骨細胞組較支架組減輕的多，支架復合軟骨細胞組炎性反應最輕，抗炎效果最好，見圖1。

2.3IL-10、IL-22、TGF-β1在兔膝關節(jié)滑膜的表達 模型組兔膝關節(jié)滑膜組織IL-10表達較正常組明顯減少，IL-22、TGF-β1較正常組明顯增多(均P<0.01)；與模型組相比，各治療組兔膝關節(jié)滑膜組織IL-10表達明顯增(P<0.05，P<0.01)，軟骨細胞組和支架復合軟骨細胞組兔膝關節(jié)滑膜組織IL-22、TGF-β1表達明顯減少(P<0.05，P<0.01)；見表1和圖2。

圖1 各組兔膝關節(jié)滑膜HE染色(×400)

組別IL-10IL-22TGF-β1正常組53.5±10.12)43.6±10.42)21.7±7.12)模型組17.2±4.777.5±17.651.5±11.9軟骨細胞組32.1±13.22)57.6±16.81)29.6±9.32)支架組23.4±3.91)63.1±15.126.5±11.12)支架復合軟骨細胞組31.6±8.32)47.1±13.72)44.5±9.5

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

圖2 各組兔膝關節(jié)滑膜IL-10、IL-22、TGF-β1免疫組化檢測結(jié)果(×400)

3 討 論

支架材料作為細胞相互作用的模板和細胞外基質(zhì)的形成，為新形成的組織提供結(jié)構(gòu)支持；以骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞具有多向分化潛能，取材簡單，易分離，低免疫原性等特點，具有分化為軟骨細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等骨組織細胞的能力；細胞生長因子(如TGF-β)能促進骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化和缺損處骨組織愈合的作用〔9〕。支架結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細胞的組織工程技術在修復骨組織缺損方面已開展應用〔10〕。本研究進一步驗證了組織工程在治療RA上有良好的應用前景。

RA的主要病理改變?yōu)榛ぱ?，表現(xiàn)為滑膜增生和炎性細胞浸潤。Th17細胞在關節(jié)滑膜中主要分泌IL-17、IL-22、TFN-α等促炎因子，Treg細胞參與免疫應答的調(diào)控，主要分泌IL-10、TGF-β1等抗炎因子，通過抑制自身反應的淋巴細胞，維持機體免疫耐受，抑制炎性反應。周大兵等〔11〕發(fā)現(xiàn)IL-17在RA滑膜組織中的表達明顯升高，IL-10在RA滑膜組織中的表達相對降低，且二者具有相關性，提示IL-17/IL-10平衡失調(diào)在RA的發(fā)病機制中具有一定作用。王秋燚等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)IL-17通過相關信號轉(zhuǎn)導通路，從多個方面對RA發(fā)揮致病作用。

IL-10不僅能夠預防關節(jié)炎的發(fā)生，還可抑制關節(jié)炎的發(fā)展，在RA的發(fā)病過程中具有保護作用?？捎筛渭毎⒕奘杉毎?、T細胞、B細胞等分泌，可抑制IL-1、TNF-α等促炎因子表達而發(fā)揮抗炎作用。IL-22屬IL-10細胞因子家族成員，可由多種免疫細胞分泌產(chǎn)生，如Th1、Th22、Th17。在膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)實驗中，IL-22同時誘導促炎因子和抗炎因子產(chǎn)生，IL-22對早期關節(jié)炎有保護作用，其機制與增加IL-10水平有關〔13〕，提示IL-22在關節(jié)炎中具有保護及致病雙重作用，取決于疾病發(fā)展的不同階段。研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)滑膜IL-22水平提高，與疾病活動性及骨破壞相關，可成為評估病情與骨破壞的指標〔14〕，提示IL-22有望成為RA治療的新靶點。TGF-β超家族成員調(diào)節(jié)著多種細胞的生長發(fā)展過程包括細胞的生長、分化、凋亡、血管生長、細胞外的相互作用及免疫反應等〔15〕。TGF-β1是一種有雙向調(diào)節(jié)能力的細胞因子，TGF-β1單獨作用時，可誘導初始T細胞分化為Treg細胞，而在TGF-β1和IL-6的共同作用下可誘導初始T細胞分化為Th17細胞，TGF-β1作為一種雙向調(diào)節(jié)的細胞因子，作用復雜，可能涉及RA的病程長短和病情活動度。陳瑞林等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中Treg細胞占CD4+T 細胞的百分率顯著低于健康對照者，且血清中TGF-β1的表達顯著高于健康對照者。

綜上，海藻酸鈉支架復合組織工程化軟骨細胞抗炎機制可能是通過上調(diào)滑膜IL-10表達，下調(diào)IL-22和TGF-β1表達起抗炎作用的。由于上述細胞因子的產(chǎn)生涉及多條細胞信號通路，因此，海藻酸鈉支架復合組織工程化軟骨細胞抗炎的具體機制與細胞因子之間是如何發(fā)揮作用的及細胞因子之間平衡失調(diào)對RA的發(fā)生發(fā)展有何影響，有待進一步研究。