李大剛 楊熠 劉海燕 羅濱

(暨南大學附屬第二臨床醫(yī)學院 深圳市人民醫(yī)院 1心臟大血管外科，廣東 深圳 518020；2婦科；3深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院心血管外科)

隨著人口老齡化的加劇及動脈粥樣硬化發(fā)病率的增高，心臟瓣膜病的發(fā)病率在逐年增加，其中老年退行性主動脈瓣病變在心臟瓣膜病變中占據(jù)了較大的比例〔1，2〕。主動脈瓣膜間質(zhì)細胞是心臟主動脈瓣膜中含量最為豐富的細胞，具有保持瓣膜正常結(jié)構(gòu)和功能的重要作用〔3〕。瓣膜間質(zhì)細胞凋亡和鈣結(jié)節(jié)形成參與了瓣膜退行性病變和鈣化形成。其生物學功能的改變對主動脈瓣膜病變的發(fā)生起重要作用〔4〕。雷洛昔芬(RAL)屬于第二代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，最初主要用于女性絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和乳腺癌的治療，后來在心血管方面研究發(fā)現(xiàn)，RAL 和其他一些SERM 均具有改善血管內(nèi)皮細胞功能，擴張冠狀動脈，調(diào)節(jié)血脂等功能，并且對動脈粥樣硬化和靜脈血栓形成等疾病亦具有保護作用〔5，6〕。RAL通過雌激素效應元件(ERE)或其他途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能，從而保護血管內(nèi)皮功能〔7，8〕。本研究通過對高糖高脂飲食的小鼠給不同濃度的RAL 3個月，檢測RAL對主動脈瓣脂肪化和鈣化的影響及相關(guān)凋亡基因的作用。

1 材料和方法

1.1動物 共50只雄性C57小鼠(10周齡)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)在深圳市人民醫(yī)院無特定病源動物房。深圳人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會同意本研究所有實驗。

1.2RAL給藥實驗 小鼠隨機分為5組，每組10只。對照組(普通飼料喂養(yǎng))、高糖高脂組(高糖高脂飲食)、RAL低劑量組(RAL 4.5 mg/kg+高糖高脂飲食)、RAL中劑量組(RAL 9.0 mg/kg+高糖高脂飲食)、RAL高劑量組(RAL 18.0 mg/kg+高糖高脂飲食)。每天灌胃給藥共3個月，實驗期間每天觀察動物飲食活動情況。

1.3實時定量PCR 給藥3個月后斷頸處死動物。實時定量PCR(RT-qPCR)檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的相對表達水平。解剖取主動脈瓣組織提取總RNA用TRIzol 試劑盒(Invitrogen，USA)。RNA的濃度和純度用紫外分光光度計檢測其在260和280 nm的吸光度。逆轉(zhuǎn)錄反應用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(寶生物工程有限公司)完成，每反應10 μl總體系。RT-qPCR用預混液試劑盒(寶生物工程有限公司)完成，每反應20 μl體系。PCR擴增用一步法定量PCR系統(tǒng)完成(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，Caspase-3的相對表達水平參照標準化的β-actin內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt表示，并評估樣本間差異。上述各試劑盒操作根據(jù)供應商操作說明。Caspase-3：正義鏈5′-TGTCATCTCGCTCTGGTACG-3′，反義鏈5′-CCCTTTCTGCCTGTCTTCTG -3′；GDPDH：正義鏈5′-ACCTCAACTACATGGTCTAC-3′，反義鏈5′-TTGTCATTGAGAGCAATGCC-3′。

1.4組織學檢測 給藥3個月后斷頸處死動物。取心臟主動脈瓣組織，在4%的甲醛緩沖液固定24 h，用逐級乙醇和二甲苯充分脫水與透明，56～58℃石蠟包埋，組織切片厚5 μm，脫蠟至水。用蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)染色。茜素紅染色：觀察主動脈瓣組織鈣鹽沉積情況。茜素紅染色步驟為切片脫蠟至水后自來水洗2 min，0.1 %茜素紅染色30 min，甘油明膠封片。免疫組化染色：切片脫蠟至水后，3%過氧化氫(H2O2)溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓或酶消化修復抗原，加入Caspase-3抗體(1∶40)室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。滴加50 μl即用型快捷免疫組化試劑，室溫下孵育10 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。結(jié)果用Image Proplus6.0(IPP6.0)專業(yè)圖像分析軟件進行圖像定量分析，計算各組的IOD值。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1組織學分析 HE染色發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量脂肪化區(qū)域，給不同濃度的RAL后主動脈瓣脂肪化得到了不同程度的改善，尤其是RAL高劑量組發(fā)現(xiàn)很少脂肪化區(qū)域。見圖1。茜素紅染色發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量點狀紅色鈣鹽沉積區(qū)域，但是在不同濃度RAL藥物組這種點狀紅色鈣鹽沉積點明顯減少了，尤其RAL高劑量組基本沒有呈現(xiàn)這種鈣化點。見圖2。免疫組化發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣標本切片有大量的棕黃色Caspase-3蛋白陽性表達，同時陽性表達區(qū)域定量分析也發(fā)現(xiàn)高脂高糖組明顯高于RAL低、中、高劑量組及對照組(P<0.05,P<0.01)，且RAL高劑量組極少觀察到陽性表達。見圖3、表1。

圖1 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜影響(HE染色，×200)

圖2 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜影響(茜素紅染色，×200)

圖3 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜Caspase-3蛋白表達的影響(免疫組化染色，×200)

2.2RT-QPCR檢測Caspase-3 mRNA相對表達水平 RAL低、中、高劑量組及對照組小鼠主動脈瓣組織中Caspase-3 mRNA表達均顯著低于高糖高脂組(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組Caspase-3 mRNA及蛋白表達比較

與高糖高脂組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

3 討 論

心臟瓣膜病是危害人類健康的重要疾病，隨著年齡的增長退行性變性導致的主動脈瓣膜病變在心臟瓣膜病變中占主導地位，是導致主動脈瓣病變和接受主動脈瓣置換手術(shù)的最常見的原因〔9，10〕。主動脈瓣病變是一個復雜的病理過程，過去主動脈瓣膜的病變被普遍認為是一種長期機械壓力誘導下的被動的、非調(diào)控的過程。目前，由于對主動脈瓣膜病變的發(fā)生和發(fā)展機制缺乏了解，對于早期瓣膜病變?nèi)狈τ行У母深A手段。瓣膜的鈣化是該病主要病理癥狀，是受到活躍調(diào)控的主動的生物學過程〔11〕，這個復雜的調(diào)控過程中，瓣膜間質(zhì)細胞的增殖和凋亡參與瓣膜病變和鈣化形成〔12，13〕。研究表明，高脂飲食可誘導新西蘭大白兔的瓣膜出現(xiàn)病變，而在病變的瓣膜中細胞凋亡的數(shù)目明顯增加〔14〕。

RAL在心血管疾病方面有治療作用〔15〕，可改善血管內(nèi)皮細胞功能〔16，17〕，擴張冠狀動脈，調(diào)節(jié)血脂〔18〕，并且對動脈粥樣硬化和靜脈血栓形成有保護作用〔19，20〕。RAL通過抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細胞的凋亡，對腎功能不全所致的瓣膜鈣化具有改善作用〔21〕。

長期高脂高糖飲食是心臟脂肪化的主要原因，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量脂肪化區(qū)域，給不同濃度的RAL后主動脈瓣脂肪化得到了不同程度的改善。鈣化程度分析發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量點狀紅色鈣鹽沉積區(qū)域，但是在不同濃度RAL藥物組這種點狀紅色鈣鹽沉積點明顯減少了，尤其高濃度RAL組基本沒有呈現(xiàn)這種鈣化點。調(diào)控主動脈瓣間質(zhì)細胞凋亡的蛋白表達定量分析發(fā)現(xiàn)在給RAL后其表達也得到了一定程度的抑制。

綜上所述，本研究通過建立高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣膜退行性病變模型，觀察不同濃度的RAL對主動脈瓣膜生物學功能的影響。發(fā)現(xiàn)合適的濃度RAL對主動脈瓣膜病變有一定的抑制作用，從而為RAL防治主動脈瓣膜疾病提供一定的實驗參考。