畢紅東 李寶群 萬立野

(1承德醫(yī)學院，河北 承德 067000；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

類固醇激素受體(VDR)是核轉錄因子的一種，屬于/甲狀腺激素受體超家族的成員。1，25(OH)2D3與VDR結合為激素受體復合物后能夠調節(jié)靶基因的轉錄，調控細胞分化與抑制增殖〔1〕；調控藥物代謝酶及內外源性物質轉運體等〔2〕。近年來針對VDR在內的類固醇激素受體基因突變的研究逐漸成為熱點〔3〕。野生型VDR編碼的蛋白質含有427個氨基酸，起始密碼子區(qū)突變造成ATG中的(T)變異為(C)后導致突變型蛋白質變?yōu)?24個氨基酸，體外研究顯示將攜帶VDR的cDNA質粒轉染人結腸癌細胞系COS-7后發(fā)現(xiàn)癌細胞表達VDR mRNA，并且生長與其特異性配體骨化三醇的劑量相關，表明1，25(OH)2D3抗腫瘤作用是通過受體VDR介導〔4〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)患者攜帶VDR基因型不同則腫瘤易患性也不同〔5〕；目前對VDR基因翻譯起始密碼子變異的研究多集中在突變與疾病發(fā)生方面，并未對具體調控做系統(tǒng)的分析。本研究利用分子遺傳學技術，通過構建報告基因載體，利用細胞轉染來驗證其表達活性，為進一步深入研究該基因提供體外平臺。

1 材料和方法

1.1材料 Trizol 試劑(Hyclone)，質粒小量提取試劑盒和質粒DNA大量制備試劑盒以及DNA 膠回收試劑盒(Qiagen公司)，逆轉錄試劑盒購自Promega公司，T4 DNA連接酶，T4 PNK RT-PCR 試劑盒，GeneRuler 100 bp DNA Ladder購自MBI公司，EcoRⅠ內切酶，XhoⅠ內切酶HindⅢ 內切酶，STAR HS DNA聚合酶、5倍緩沖液dNTP DNA JM109菌種(TIANGEN)；普通瓊脂糖、低熔點瓊脂糖，氨芐青霉素，酵母，F(xiàn)BS，LB液體培養(yǎng)基均購自TaKaRa公司，COS-7細胞株(上海細胞所)，載體pcDNA3.1(-)B-myc/his，PGEM-T載體，pGL3-promoter載體內切酶和聚合酶購自TaKaRa公司；Dual-Luciferase Reporter Assay system和DMEM和血清購自Invitrogen公司，PCR引物合成由上海博亞公司。

1.2方法

1.2.1人VDR基因克隆 Trizol法制備總RNA，野生型所用引物：5′-tagaattctggaggcaatggcggc-3′和5′-actaagctttctcattgccaaacacttc-3′；突變體所用的引物為5′-tagaattcgtggcggccagcacttc-3′和5′-actaagcttgtcattgccaaacacttc-3′將肝臟組織(承德醫(yī)學院生物標本庫)在液氮中磨碎，Trizol法制備。PCR體系和條件：產(chǎn)物2.5 μl，dNTP 1.5 μl，5×緩沖液5 μl，前引物0.5 μl，后引物 0.5 μl，0.5 μl聚合酶，混勻后上樣置于PCR儀，參數(shù)設定為94 ℃10 min開始，然后55℃15 s，而后72 ℃90 s，一共35 個循環(huán)，最后再次72℃10 min。將T4 DNA連接酶與PGEM-T克隆載體將cDNA目的片段進行連接。

1.2.2野生型和起始密碼子區(qū)突變VDR真核表達載體的構建 VDR目的片段(約1.3 kb)純化后從T克隆載體上消化后與表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his連接，連接體系如下：緩沖液1 μl，T4連接酶1 μl，PCR 產(chǎn)物5 μl補水至10 μl，產(chǎn)物與載體比例為1∶4，混勻離心后轉化感受態(tài)細菌，初步鑒定采用酶切電泳，最終鑒定采用測序(上海英駿生物公司)。野生型載體人VDR構建成功后以其為模板引入突變位點引物進行PCR擴增，按同樣方法將擴增后產(chǎn)物與表達載體pcDNA3.1-myc/his B(-)連接，測序驗證命名為人VDR起始密碼子區(qū)突變型(圖1)。

圖1 真核表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR

1.2.3轉染處理 DMEM+10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)COS-7，在37 ℃和CO2為5%的條件下，當細胞匯合生長到80%時傳代接種至96 孔培養(yǎng)板上。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制的轉染試液，海腎熒光素酶報告質粒用Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，平行6 個孔，每個樣品至少重復3次。轉染實驗分為兩組，一組為野生型載體組，另一組為突變體VDR，以phRL-SV40報告載體作為內對照；空載體pcDNA3.1(-)B-myc/his為空白對照；各待檢載體進行共轉染及藥物處理。

1.2.4雙熒光素酶活性分析 報告基因試劑處理30 h后，細胞用PBS洗滌1次，加入裂解液裂解細胞，在檢測管中加入藥物1，25(OH)2VD3，對照phRL-SV40和Lip 2000混勻后放置于檢測孔中測定熒光素酶活力。

1.3統(tǒng)計處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1真核表達載體人核受體野生型VDR的構建 VDR全長擴增應用RT-PCR方法，VDR cDNA為427個氨基酸(約1.3 kb)，擴增產(chǎn)物片段與理論相符，擴增產(chǎn)物和載體分別用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后進行連接形成重組載體pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR(圖1和圖2)，提質粒再次行上述兩種酶切檢測并同時測序，GenBank序列分析表明，酶切片段長度與插入片段和目的片段長度序列方向完全一致，核受體VDR mRNA編碼區(qū)已重組到表達載體中(見圖3，圖4)。

泳道1：Ladder(3 kb)；2～6泳道：重組VDR雙酶切后的片段〔目的片段1.3 kb，空載體 PC-DNA3.1(+)/-his 5.5 kb〕；2與6泳道：野生型；3～5泳道：突變體圖2 重組表達質粒pcDNA3.1(-)B-myc/his/h VDR(野生型與突變型)酶切結果

圖3 野生型人VDR測序分析

圖4 突變型人VDR測序分析

2.2真核表達載體人核受體VDR突變型的構建 以野生型人VDR質粒菌液作模板，根據(jù)CDR起始密碼子區(qū)T/C突變設計相應引物(與野生型相比丟失3個氨基酸也就是9個堿基)，所以片段長度基本不變(1.3 kb)，PCR擴增hVDR突變全長cDNA其余方法同構建野生型載體。同樣用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切檢測(圖2)。挑選陽性克隆進行測序然后進行質粒大量抽提做細胞轉染備用。

2.3熒光素酶報告基因載體的構建 通過共轉染pcDNA3.1-VDR-和pGL3-VDR-luc及內對照質粒pRL-SV40 建立的 VDR報告基因體系，隨著特異性配體濃度的增加熒光素酶表達量也隨之增加，轉染野生型和突變體的VDR質粒載體在3個1，25(OH)2VD3濃度組，代表VDR轉錄活性的熒光素酶比活性值與溶媒對照及空載體對照有顯著差異，轉染突變體組mRNA水平的轉錄激活能力高于轉染野生型組(圖5)。

圖5 各處理組熒光素酶比活性值的比較

3 討 論

真核表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his大小為5.5 kb，攜帶有多克隆酶切位點和巨細胞病毒(pcMV)加強型啟動子合并含有抗新霉素基因，許多哺乳動物真核細胞都可以高效表達，因此應用pcDNA3.1(-)B-myc/his作為表達載體可為研究目的基因表達奠定良好的實驗基礎；另外我們以PGEM-T作為克隆載體，主要是因為T連時只做單酶切不用做方向性選擇，操作簡單及連接效率較高。而且pcDNA3.1(-)B-myc/his(空)大小為5.5 kb，PGEM-T本身僅3 kb長，如果做定點突變那么空載體略顯過長會導致誘變效率低下。本模型采用熒光素酶檢測表達載體轉錄活性是基于以下幾點：熒光素酶檢測及其靈敏且速度很快在幾秒鐘內可以完成兩種熒光素酶的測定，不但方便而且可避免放射性物質；同時上樣無需預處理且對內源背景要求較低，高通量藥物篩選選用次方法最為適用；線性范圍分析數(shù)量級可達10個左右，微量細胞裂解物即可滿足實驗所需；大量轉染細胞后的熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)還可在細胞96孔板進行，報告基因分析也會受轉染效率或細胞活性等因素影響，為此我們設立了啟動子轉錄的海腎熒光素酶作為內對照報告基因與實驗報告基因共轉染的方法以降低細胞數(shù)目、狀態(tài)、轉錄和裂解效率等原因造成的誤差，從而使得結果更加準確。有關類固醇激素受體VDR對下游一系列靶基因的轉錄調控的研究近來日益受到重視。體外細胞水平已經(jīng)證實1，25(OH)2D3通過受體VDR調控下游靶基因轉錄表達，而受體被iRNA干擾后其誘導作用幾乎消失〔6〕。在美國黑人、白人、新加坡人的研究中分別發(fā)現(xiàn)起始密碼子區(qū)突變者結腸腫瘤易患性比野生型和雜合子基因型者顯著降低〔7〕。但是此位點突變與腫瘤發(fā)生是否存在關聯(lián)及其機制目前缺乏相關的研究，本實驗構建了含有人類固醇激素受體VDR起始密碼子突變的報告基因系統(tǒng)，通過轉染COS-7 細胞驗證了VDR具有轉錄活性，為揭示受體在疾病發(fā)生反應差異的遺傳機制和證實遺傳變異對疾病發(fā)生發(fā)展的影響起決定作用的分子機制初步搭建了一個體外實驗平臺。