楊金華 劉向前 趙天增

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，河南 南陽(yáng) 473000)

穿心蓮內(nèi)酯(AD)是傳統(tǒng)中藥穿心蓮的有效成分之一，被證實(shí)可通過(guò)抑制核因子(NF)-κB信號(hào)通路和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9發(fā)揮抗肺癌的作用，是一種有前途的抗肺癌候選藥物〔1〕。白細(xì)胞介素(IL)-6是一種癌癥相關(guān)炎癥因子，不僅介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2,3〕。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是使上皮細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)而引起癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要生物過(guò)程。已有研究〔4～6〕證實(shí)，IL-6可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)EMT發(fā)生，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移；AD可通過(guò)抑制促EMT細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)抑制前列腺癌的進(jìn)展，但其是否影響IL-6誘導(dǎo)的肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移并不清楚。非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，約占肺癌的80%，而肺腺癌又占非小細(xì)胞肺癌的50%以上〔7〕。本研究旨在探討AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 AD(純度≥95%)、二甲基亞砜、噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司。IL-6購(gòu)于美國(guó) BioVision公司。MMP-9抗體、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、IκBα抗體和β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體和波形蛋白(Vimentin)抗體購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠免疫球蛋白(Ig)G購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，ELX800酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek公司。倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific Heraeus公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源及其培養(yǎng) 將來(lái)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心的人肺腺癌細(xì)胞株A549在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測(cè)AD對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。將生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔200 μl(濃度106個(gè)/ml)平鋪于96孔細(xì)胞板上。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將其分為9組，分別加入含有0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、30.0和50.0 μmol/L濃度AD的培養(yǎng)基120 μl，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。作用24 h后，加入20 μl MTT溶液。反應(yīng)4 h后，加入100 μl二甲基亞砜使結(jié)晶充分溶解。以酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率(%)=(1-藥物組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率。后期以20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L濃度IL-6的作用于A549細(xì)胞，MTT法檢測(cè)IL-6對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，具體步驟同上。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將不同濃度AD處理后的A549細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化后，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基制成濃度為3×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。以每孔100 μl加入到matrigel膠包被的Transwell小室的上室中。下室內(nèi)，加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，從24孔細(xì)胞板中取出小室，以棉簽小心擦去小室上表面未穿過(guò)的細(xì)胞。采用甲醇和蘇木精-伊紅分別對(duì)小室下表面的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。采用顯微鏡觀(guān)察統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。結(jié)果取隨機(jī)選取的6個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)的均值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western印跡檢測(cè) 參照總蛋白提取試劑盒步驟提取待測(cè)A549細(xì)胞的總蛋白后，采用BCA法對(duì)總蛋白的濃度及其純度進(jìn)行檢測(cè)。取蛋白樣品50 μg加入到十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳通道孔中行電泳分離。采用濕式法轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉處理2 h。分別加入MMP-9抗體(1∶500)、E-cadherin抗體(1∶500)、Vimentin抗體(1∶800)、p-IκBα抗體(1∶500)、IκBα抗體(1∶500)和內(nèi)參β-actin抗體(1∶1 000)孵育過(guò)夜。次日，經(jīng)TBST溶液洗膜5 min×3次后，避光條件下滴加化學(xué)發(fā)光劑顯色曝光。采用Gel-Pro 3.1軟件進(jìn)行分析。以目的條帶的灰度值/內(nèi)參條帶的灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的AD對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 以不同濃度的AD處理A549細(xì)胞24 h后，與0.0 μmol/L的抑制率〔(1.64±1.52)%〕比較，0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD對(duì)A549細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響〔(2.16±1.67)%、(4.16±2.23)%、(8.15±5.48)%，P>0.05〕，而5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、15.0 μmol/L、30.0 μmol/L和50.0 μmol/L濃度的AD能夠呈濃度依賴(lài)性抑制A549細(xì)胞增殖〔(18.31±2.11)%、(27.24±3.46)%、(48.92±4.93)%、(65.38±5.76)%、(73.59±7.07)%，F(xiàn)=130.315，P=0.000〕。

2.2不同濃度IL-6對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 與0 μg/L抑制率〔(2.80±1.54)%〕比較，20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L IL-6處理A549細(xì)胞24 h后，IL-6對(duì)A549細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響〔(5.14±2.68)%、(8.31±4.76)%、(6.21±3.80)%，F(xiàn)=1.352，P=0.325〕。后續(xù)選用低濃度(20 μg/L)的IL-6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲的影響 給予20 μg/L濃度的IL-6處理后，A549細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(126.37±11.45 vs 48.35±6.72,P<0.05)。然而，給予0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD處理后，IL-6對(duì)A549細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用明顯受到抑制(101.55±8.72、40.62±6.34、36.72±4.94 vs 126.37±11.45，P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 Transwell小室檢測(cè)各組A549細(xì)胞的侵襲結(jié)果(×200)

2.4AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT的影響 采用Western印跡進(jìn)一步檢測(cè)AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)的EMT的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6刺激能夠明顯降低A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)，而升高Vimentin蛋白的表達(dá)；而以0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD作用后，IL-6對(duì)A549細(xì)胞上述作用明顯減弱，且呈一定的濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖2和表1。

1～5：對(duì)照組、IL-6組、0.5 mol/L AD+IL-6組、1.0 mol/L AD+IL-6組、3.0 mol/L AD+IL-6組，下圖同圖2 Western印跡檢測(cè)A549細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)

組別E-cadherinVimentin對(duì)照組2.34±0.160.17±0.03IL-6組 1.00±0.081)1.00±0.061)0.5 μmol/L AD + IL-6組1.27±0.112)0.83±0.052)1.0 μmol/L AD + IL-6組1.59±0.132)3)0.60±0.062)3)3.0 μmol/L AD + IL-6組1.75±0.152)3)0.55±0.052)3)F/P值46.644/0.000104.141/0.000

與對(duì)照組相比較：1)P<0.05；與IL-6組比較：2)P<0.05；與0.5 μmol/L AD+ IL-6組相比較：3)P<0.05

2.5AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞NF-κB通路活化的影響 為了探討AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，采用Western印跡進(jìn)一步檢測(cè)A549細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6刺激后，A549細(xì)胞中p-IκBα蛋白表達(dá)升高，而IκBα蛋白表達(dá)降低，NF-κB信號(hào)通路激活；而0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD能夠呈濃度依賴(lài)性明顯抑制IL-6對(duì)549細(xì)胞中NF-κB通路的活化。見(jiàn)圖3和表2。

圖3 Western印跡檢測(cè)A549細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

組別p-IκBαIκBα對(duì)照組0.13±0.021.55±0.06IL-6組1.00±0.081)1.00±0.091)0.5 μmol/L AD + IL-6組0.83±0.072)1.23±0.072)1.0 μmol/L AD + IL-6組0.62±0.062)3)1.56±0.042)3)3.0 μmol/L AD + IL-6組0.24±0.042)3)4)2.15±0.022)3)4)F/P值123.666/0.000151.508/0.000

與對(duì)照組相比較：1)P<0.05；與IL-6組比較：2)P<0.05；與0.5 μmol/L AD+ IL-6組比較：3)P<0.05；與1.0 μmol/L AD+ IL-6組比較：4)P<0.05

2.6AD對(duì)IL-6誘導(dǎo)的A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9的影響 給予IL-6處理后，A549細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(1.03±0.11 vs 0.68±0.08,P<0.05)；而給予0.5、1.0和3.0 μmol/L AD作用后，IL-6對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱(0.73±0.08、0.55±0.05、0.47±0.04 vs 1.03±0.11，P<0.05)，且呈一定的濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

IL-6可協(xié)調(diào)輔助性T細(xì)胞(Th)17型細(xì)胞因子、TNF-α激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3和NF-κB促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔8〕。骨髓中高表達(dá)的IL-6可通過(guò)MMP-9促進(jìn)胰腺癌的侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔9〕；IL-6可激活酪氨酸激酶(JAK)2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌EMT和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，抑制其表達(dá)可改善腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移〔10〕。IL-6與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔11〕。IL-6在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，與腺癌組織類(lèi)型相關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果與姜伊娜〔4〕研究發(fā)現(xiàn)的IL-6可通過(guò)激活毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因(ATM)-NF-κB通路促進(jìn)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制部分吻合。NF-κB信號(hào)通路是一條公認(rèn)的炎癥信號(hào)通路，也是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，IκBα是NF-κB的抑制蛋白；一般情況下以無(wú)活性的三聚體復(fù)合物p65/p50/IκBα形式存在，但當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子等刺激時(shí)，IκBα磷酸化降解釋放p65/p50二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游相關(guān)基因，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過(guò)程〔13，14〕。細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要病理過(guò)程，而MMPs蛋白家族在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；MMP9是MMPs家族成員，也是NF-κB信號(hào)通路下游相關(guān)基因，在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔15，16〕。可見(jiàn)，IL-6刺激可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)了A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

AD是從穿心蓮中提取的一種二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，具有抗炎、抗腫瘤和抗心血管疾病等藥理活性〔17，18〕；而近年來(lái)隨著中藥抗腫瘤研究的熱潮，AD抗腫瘤的作用備受關(guān)注。研究〔19，20〕發(fā)現(xiàn)，AD不僅可通過(guò)Toll樣受體(TLR)4/NF-κB/MMP-9信號(hào)通路抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖；還可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳類(lèi)動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的活力與侵襲能力，并增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡能力。AD可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞活性、癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，是一種潛力巨大的新型抗腫瘤藥物。近年來(lái)有研究〔6〕指出，AD可通過(guò)抑制促EMT的細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)抑制前列腺癌進(jìn)展，但其是否通過(guò)這一機(jī)制改善非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程尚未可知。本研究提示，AD可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化抑制IL-6誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。