劉玲 林杰 李建民 王如珠

(泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300)

原發(fā)性高血壓(EH)是常見(jiàn)的慢性病，大量研究證實(shí)此類疾病與多種心腦血管疾病的發(fā)生有密切相關(guān)性〔1～3〕，隨著社會(huì)老齡化的加劇此類疾病的發(fā)病率也有所增加。EH的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前主要認(rèn)為受到遺傳、環(huán)境、生活習(xí)慣等因素的共同影響〔4〕。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，EH的基因水平研究也取得了一定進(jìn)展，研究顯示內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因是EH的重要候選基因〔5，6〕，但關(guān)于eNOS基因rs3918188位點(diǎn)的多態(tài)性與漢族EH患者的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本文就eNOS基因rs3918188位點(diǎn)的多態(tài)性與漢族EH的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1臨床資料 研究對(duì)象選取2013年1月至2017年4月泰州市人民醫(yī)院收治的262例EH患者作為高血壓組、同期的260例健康體檢者作為對(duì)照組。高血壓組男140例、女122例，平均年齡(54.9±11.2)歲，均為漢族；對(duì)照組男139例、女121例，平均年齡(55.6±10.8)歲，均為漢族。EH患者符合2010年中國(guó)高血壓防治指南中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。兩組年齡、性別、民族等構(gòu)成對(duì)比上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①民族為漢族；②符合EH診斷(高血壓組)；③正在使用降壓藥物(高血壓組)；④知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性高血壓；②先天性心臟病、心瓣膜病、心肌病及肝腎功能不全者；③有內(nèi)分泌病史者(對(duì)照組)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 兩組受檢者均禁食12 h，次日清晨空腹取外肘靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，采用上海研生公司產(chǎn)DNA提取試劑盒提取DNA，采用美國(guó)Biotek公司產(chǎn)蛋白質(zhì)核酸定量分析儀對(duì)DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)化至30 ng/μl。

1.3.2基因分型 采用TaqMan法進(jìn)行基因分型，儀器為ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Biotek公司)，建立10 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：60℃下30 s，95℃下預(yù)變性10 min，95℃下15 s、60℃下60 s循環(huán)55次，60℃下30 s結(jié)束。采用SOS2.1軟件包處理基因分型結(jié)果，隨機(jī)抽取5%樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)。復(fù)測(cè)結(jié)果一致率100%。

1.3.3測(cè)序驗(yàn)證 檢測(cè)美國(guó)生物技術(shù)信息數(shù)據(jù)庫(kù)中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)序列，采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由金斯瑞生物科技公司合成。eNOS測(cè)序引物上游序列：5′-CACGTAGA-GGATCTCAACTTCGTCC-3′，下游序列為5′-GTGAACTCCCAAGATA-GTCCTACT-3′。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行χ2檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本代表性。

2 結(jié) 果

2.1eNOS基因rs3918188位點(diǎn)基因型檢驗(yàn)結(jié)果 eNOS基因rs3918188位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1。隨機(jī)從檢測(cè)結(jié)果中選取5%樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)，測(cè)序結(jié)果與PCR結(jié)果完全一致，見(jiàn)圖2。

2.2eNOS基因rs3918188位點(diǎn)基因型分布結(jié)果 高血壓組和對(duì)照組A/G基因型和等位基因頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 eNOS基因rs3918188位點(diǎn)RCR擴(kuò)增圖

a：AA純合子，b：GG純合子，c：AG雜合子圖2 eNOS基因rs3918188位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

表1 兩組eNOS基因rs3918188位點(diǎn)基因型及等位基因頻率對(duì)比〔n(%)〕

3 討 論

EH是導(dǎo)致多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，近年來(lái)統(tǒng)計(jì)顯示成人高血壓發(fā)病率在25%以上〔8〕，EH的防治已經(jīng)成為重點(diǎn)問(wèn)題。漢族是我國(guó)最大的民族，人群遺傳背景相對(duì)復(fù)雜，但就同一個(gè)地區(qū)的人群進(jìn)行研究，可一定程度上縮小環(huán)境、生活方式等因素的影響，將遺傳異質(zhì)性控制在較小的范圍。eNOS基因與EH的相關(guān)性近年來(lái)被臨床重視，eNOS基因位于7號(hào)染色體q35～36區(qū)域，包含26個(gè)外顯子、26個(gè)內(nèi)含子，對(duì)應(yīng)mRNA可生成1 203個(gè)氨基酸產(chǎn)物，eNOS屬于一氧化氮限速酶，而一氧化氮在血壓調(diào)節(jié)和循環(huán)功能維持中有著重要的意義，如果eNOS基因發(fā)生改變，一氧化氮(NO)的合成就會(huì)出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致患者血壓出現(xiàn)降低或升高，因此臨床認(rèn)為eNOS基因?qū)儆贓H的重要候選基因〔9,10〕。

從目前國(guó)內(nèi)外研究情況來(lái)看〔11〕，對(duì)于eNOS基因的研究主要集中于啟動(dòng)子區(qū)的786位點(diǎn)、894位點(diǎn)及第4內(nèi)含子的多態(tài)性上，且結(jié)論頗有爭(zhēng)議。本次研究選取的rs3918188位點(diǎn)基因位于第14內(nèi)含子上。內(nèi)含子在基因組中有著重要的基因調(diào)控作用，能夠通過(guò)自身剪接對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，目前關(guān)于同屬于第14內(nèi)含子的rs3918181位點(diǎn)研究較多，閆雪等〔12〕認(rèn)為EH患者的rs3918181位點(diǎn)基因型頻率改變是導(dǎo)致發(fā)病的主要原因；方玲等〔13〕研究也顯示rs3918181位點(diǎn)上EH患者與健康體檢者的基因、等位基因頻率有顯著差異；但張旺德等〔14〕的研究顯示EH患者的rs3918181位點(diǎn)基因、等位基因頻率與健康體檢者對(duì)比無(wú)顯著差異。這說(shuō)明目前關(guān)于EH基因多態(tài)性的研究尚存在爭(zhēng)議，考慮原因一方面與遺傳異質(zhì)性有關(guān)，一方面則受到環(huán)境、生活方式等因素的影響。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于rs3918188位點(diǎn)的報(bào)道尚少，盧賢貴等〔15〕對(duì)新疆哈薩克族人群的eNOS基因rs3918188位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示EH患者和健康體檢者對(duì)比eNOS基因rs3918188位點(diǎn)基因、等位基因頻率分布無(wú)顯著差異，且對(duì)eNOS基因rs3918188位點(diǎn)和rs7830位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示兩個(gè)位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡，與本研究結(jié)論相符。本研究顯示漢族EH的發(fā)生可能與eNOS基因rs3918188位點(diǎn)多態(tài)性無(wú)明顯相關(guān)。本次僅選取漢族人群作為對(duì)象進(jìn)行了研究，對(duì)于其他人群eNOS基因rs3918188位點(diǎn)多態(tài)性分布特點(diǎn)的研究尚存在空缺。此外，本研究樣本量相對(duì)較小，易產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)偏差，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實(shí)。綜上所述，本次研究初步表明eNOS基因rs3918188位點(diǎn)多態(tài)性可能與漢族EH無(wú)明顯相關(guān)性。