劉 顯 董 原 彭麗珊 楊 洋 王登嶸 伍月榕 郁曉磊 于 麗④ 王 盈 肖 健④

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530001)

HIV-1屬于慢病毒屬，即使有相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其仍然可在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，且存在較長的潛伏期。HIV-1的感染對象為表達(dá)CD4的多種細(xì)胞類型，主要為CD4+T細(xì)胞。HIV-1的復(fù)制和病毒血癥首先被強(qiáng)有力的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)應(yīng)答所抑制。部分接觸HIV-1的T細(xì)胞前體分化成為可被低濃度抗原激活、細(xì)胞因子、協(xié)同刺激分子所激活的記憶性T細(xì)胞。記憶T細(xì)胞高表達(dá)CD127，可介導(dǎo)與增強(qiáng)再次免疫應(yīng)答。

CD127是長期記憶性細(xì)胞的標(biāo)志，CD8+CD127+T細(xì)胞可在無抗原刺激情況下生存[1,2]。CD127作為IL-7的α鏈?zhǔn)荏w其表達(dá)與T細(xì)胞增殖、分化和存活密切相關(guān)[3]，IL-7/IL7R介導(dǎo)的信號通路參與T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[4-6]，促進(jìn)與胸腺T細(xì)胞發(fā)育和外周T細(xì)胞增殖[7]。持續(xù)刺激IL-7信號可誘導(dǎo)初始CD8+T細(xì)胞增殖和促進(jìn)干擾素IFN-γ的產(chǎn)生[8]。相反，中斷IL-7信號則維持體內(nèi)CD8+T細(xì)胞平衡以促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞存活。在病毒感染性疾病過程中，CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)降低[9]。在HIV感染過程中，CD127表達(dá)的下調(diào)與HIV特異性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能缺陷相關(guān)[10]，也與抗病毒治療后免疫重建的失敗有關(guān)[2]。此外，IL-7已被證明是慢性病毒感染和癌癥中的重要治療性細(xì)胞因子[11]。

因此，探索外周血CD8+CD127+T細(xì)胞免疫狀態(tài)對揭示抗HIV-1感染機(jī)制具有重要意義。目前，從免疫活化與耗竭的角度探索HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T細(xì)胞與病程的相關(guān)性研究較少。本研究以CD8+CD127+T 細(xì)胞作為研究對象，選取并測定活化指標(biāo)CD38、HLA-DR，耗竭指標(biāo)PD-1的表達(dá)水平，從活化與耗竭的角度來分析探討外周血CD8+CD127+T細(xì)胞在HIV-1感染過程中的狀態(tài)變化，以探索機(jī)體調(diào)控抗HIV-1感染的細(xì)胞免疫機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 PB-anti-CD3、PerCP-anti-CD4、PE-Cy7-anti-CD38、ECD-anti-HLA-DR、APC-anti-PD-1流式抗體購自BD公司，F(xiàn)ACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀購自BD公司、高速離心機(jī)購自Eppendorf公司、Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液購自GE公司、PBS、RPMI1640、胎牛血清購自四季清公司。

1.1.2臨床資料 根據(jù)中國衛(wèi)生行業(yè)艾滋病感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 293-2008)在2012年10月至2014年10月期間收集上海市疾病預(yù)防控制中心以及山西運(yùn)城市疾病預(yù)防控制中心就診的未經(jīng)抗病毒治療HIV-1感染者59例，本研究設(shè)3個實(shí)驗(yàn)組，1個陰性對照組。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)CD4計(jì)數(shù)值分為典型進(jìn)展者(Typical progressors,TPs)29例，慢性感染者(Chronic HIV-1 infected persons,CPs)13例,HIV攜帶者(HIV Carrys，CRs)17例。

1.1.3納入標(biāo)準(zhǔn) TPs指感染至納入研究時間不超過10年、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)<350個/μl、未接受抗病毒治療者；CPs指CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥350個/μl，<500個/μl、未接受抗病毒治療者；CRs,指CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥500個/μl、感染不超過10年的未接受抗病毒治療者。陰性對照組為健康捐贈者(Healthy donors,HDs)，共16例。所有被研究者排除HBV、HCV合并感染的可能。兩組間一般資料對比無明顯差異，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)患者知情同意并取得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1外周血采集和單個核細(xì)胞分離 用EDTA抗凝管采集HIV-1感染者和健康志愿者外周靜脈血2 ml，靜置30 min后與PBS 1∶1混勻，以密度梯度分離法常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。根據(jù)采樣計(jì)數(shù)結(jié)果用含2%胎牛血清的RPMI1640調(diào)整為1×107個/ml的細(xì)胞懸液。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞PD-1、CD38、HLA-DR的表達(dá)水平 每個樣本取100 μl PBMCs懸液，加入適量熒光素標(biāo)記的抗人單克隆抗體：CD3-PB、CD4-PerCP、CD127-PE、CD38-PE-Cy7、HLA-DR-PE-TR、PD-1-APC，4℃避光孵育30 min；PBS清洗后，4℃避光孵育30 min；PBS液清洗后經(jīng)1%多聚甲醛溶液固定。用流式細(xì)胞儀檢測。本研究以CD3+CD4-T細(xì)胞群作為CD8+T細(xì)胞，以熒光扣除對照作為設(shè)門依據(jù)，分析CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1、CD38、HLA-DR的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1HIV-1感染者外周血CD8+T 細(xì)胞CD127表達(dá)降低 TPs組、CPs組、CRs組、HDs組CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)頻率分別為(22.51±8.530)%、(30.33±10.50)%、(38.62±11.94)%、(39.78±10.73)%。TPs組CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CPs組CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)低于HDs組患，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CPs組和CPs組之間、CRs組和HDs組之間CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),見圖1。

圖1 慢性HIV-1感染過程中CD8+T細(xì)胞CD127的表達(dá)Fig.1 Expression of CD127 on CD8+T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.*.P<0.05;***.P<0.001.

2.2HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T細(xì)胞上CD38的表達(dá)增高 TPs組、CPs組、CRs組、HDs組CD8+CD127+T細(xì)胞CD38的表達(dá)比例分別為(41.35±11.52)%、(28.84±14.62)%、(29.13±10.51)%、(27.21±7.607)%。TPs組CD8+CD127+T細(xì)胞CD38表達(dá)高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CPs、CRs和HDs三組間CD8+CD127+T細(xì)胞CD38表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2。

2.3HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)增高 TPs組、CPs組、CRs組、HDs組CD8+CD127+T細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)比例分別為(26.01±12.10)%、(25.39±12.40)%、(17.68±10.31)%、(12.59±9.637)%。HDs組CD8+CD127+T細(xì)胞HLA-DR表達(dá)低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CPs組CD8+CD127+T細(xì)胞HLA-DR表達(dá)高于CRs組和HDs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TPs、CPs和CRs三組間CD8+CD127+T細(xì)胞HLA-DR表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3。

圖2 慢性HIV-1感染過程中CD8+CD127+ T細(xì)胞上CD38的表達(dá)Fig.2 Expression of CD38 on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.**.P<0.01;***.P<0.001.

圖3 慢性HIV-1感染過程中CD8+CD127+T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)Fig.3 Expression of HLA-DR on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.*.P<0.05;**.P<0.01.

2.4HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)增高 TPs組、CPs組、CRs組、HDs組CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)比例分別為(13.420±7.194)%、(14.310±7.848)%、(7.303±4.951)%、(5.700±2.532)%。TPs組CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1表達(dá)高于CRs和HDs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CPs組CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1表達(dá)高于CRs組和HDs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CRs組與HDs組CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖4。

2.5HIV-1感染者外周血CD4計(jì)數(shù)與CD8+T細(xì)胞上CD127、CD8+CD127+T細(xì)胞上PD-1、CD38、HLA-DR表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析表明，HIV-1感染者CD4計(jì)數(shù)與CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)正相關(guān)(r=0.569 6，P<0.000 1)，CD8+CD127+T細(xì)胞上CD38、HLA-DR、PD-1的表達(dá)頻率與CD4計(jì)數(shù)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.418 3，P=0.001 0；r=-0.261 6，P=0.045 4；r=-0.314 2，P=0.015 4)，見圖5。

2.6HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1表達(dá)與CD38、HLA-DR的相關(guān)性 相關(guān)性分析表明，HIV-1感染者CD8+CD127+T細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)頻率與PD-1的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.642 7，P<0.000 1)；HIV-1感染者CD8+CD127+T細(xì)胞CD38的表達(dá)頻率與PD-1的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.038 97，P=0.770 0)，見圖6。

圖4 慢性HIV-1感染過程中CD8+CD127+ T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)Fig.4 Expression of PD-1 on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.**.P<0.01;***.P<0.001.

圖5 慢性HIV-1感染過程中CD4計(jì)數(shù)與CD8+T細(xì)胞CD127百分比、CD8+CD127+T細(xì)胞上CD38、HLA-DR、PD-1表達(dá)的相關(guān)性Fig.5 Correlation of CD127 expression on CD8+T cells,CD38,HLA-DR and PD-1 expression on CD8+CD127+T cells with CD4 counts during chronic HIV-1 infection

圖6 HIV-1感染者CD8+CD127+T細(xì)胞CD38、HLA-DR的表達(dá)與PD-1的相關(guān)性Fig.6 Correlation between CD38 and HLA-DR with PD-1 in CD8+CD127+T during HIV-1 infection

3 討論

抗原特異性CD8+T細(xì)胞的識別功能與殺傷作用是抗HIV-1感染的關(guān)鍵，表達(dá)IL-7受體的α鏈(IL-7Rα，又稱為CD127)是識別記憶性CD8+T細(xì)胞的標(biāo)志[1]。CD127的表達(dá)降低與諸多慢性病毒感染、癌癥的不良預(yù)后有關(guān)，CD127表達(dá)降低影響IL-7的活性，導(dǎo)致CTL的殺傷作用降低[12]。HIV-1感染者經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后，CD4+CD45RO+T細(xì)胞CD127表達(dá)恢復(fù)程度與CD4計(jì)數(shù)正相關(guān)[13-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未治療的HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞CD127的百分比顯著低于健康捐贈者。

CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)是衡量HIV-1疾病進(jìn)展的主要標(biāo)志，即使抗病毒治療也不能使患者CD4計(jì)數(shù)恢復(fù)到正常水平[15]。比較感染者的CD8+CD127+細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞水平的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示HIV-1感染者CD4計(jì)數(shù)與CD8+T細(xì)胞CD127表達(dá)正相關(guān)。這說明CD8+CD127+細(xì)胞可能有助于維持CD4+T 細(xì)胞的水平，在抗HIV-1感染過程中發(fā)揮著重要作用。由病毒引起的免疫激活可誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向記憶T細(xì)胞轉(zhuǎn)化[17]，但是隨著HIV-1病程的進(jìn)展CD8+CD127+T細(xì)胞卻逐漸減少，這種消耗CD8+CD127+T細(xì)胞的機(jī)制還不清楚，可能與免疫激活引起的耗竭有關(guān)。

為了驗(yàn)證上述假設(shè)，我們檢測了CD8+CD127+T細(xì)胞上的活化分子CD38、HLA-DR和凋亡分子PD-1的表達(dá)。PD-1因在T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞上調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡而命名，其配體為PD-L1和PD-L2。HIV Tat蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上PD-L1和PD-L2高表達(dá)，致使CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力下降，增殖受損而引起持續(xù)性的感染[18-20]。CD38和HLA-DR均表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，被認(rèn)為是T細(xì)胞活化的標(biāo)志[21,22]。差異性分析顯示，HIV-1感染者外周血中CD8+CD127+T細(xì)胞上PD-1、CD38、HLA-DR的表達(dá)均明顯高于健康對照組。且相關(guān)性分析顯示，CD8+CD127+T細(xì)胞上CD38、HLA-DR、PD-1的表達(dá)頻率與CD4計(jì)數(shù)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果提示，HIV-1感染者CD8+CD127+T細(xì)胞處于異常的高度活化、凋亡的狀態(tài)。通過進(jìn)一步分析CD38、HLA-DR、PD-1三者之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染者CD8+CD127+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)與HLA-DR的表達(dá)頻率正相關(guān)，與CD38的表達(dá)頻率無相關(guān)性。提示HIV-1感染過程中，隨著CD8+CD127+T細(xì)胞的大量的活化，PD-1可能誘導(dǎo)性表達(dá)于CD8+CD127+T細(xì)胞表面，從而使其功能趨于耗竭，這可能是HIV-1逃避免疫殺傷的一種重要機(jī)制。我們的前期研究表明[23]，HIV感染后CD8+T細(xì)胞整體呈現(xiàn)出高活化耗竭狀態(tài)，并不局限于CD8+CD127+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞上PD-1的過度表達(dá)與HIV感染過程中CD8+T細(xì)胞的免疫耗竭、功能抑制相關(guān)，通過體外阻斷PD-1/PD-L1通路可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ的能力。但值得注意的是，PD-1在HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)與HLA-DR、CD38均存在正相關(guān)關(guān)系，而在CD8+CD127+T細(xì)胞上與CD38的表達(dá)并不存在相關(guān)性。該差異提示：在CD8+T細(xì)胞的不同亞群中可能存在耗竭機(jī)制的差異。在后續(xù)的研究中，我們將比較CD8+CD127+T與CD8+CD127-T這兩群細(xì)胞中活化和耗竭的情況，并設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)，阻斷PD-1/PD-L1通路觀察上述分子的表達(dá)變化，以得出進(jìn)一步的結(jié)論。

綜上所述，我們的研究表明HIV-1感染過程中CD8+CD127+T細(xì)胞高活化耗竭可能是CD8+T細(xì)胞上CD127表達(dá)下降的原因。但是，與CD8+CD127+T細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的除CD38、HLA-DR、PD-1外，還涉及 CTLA4、CD160等眾多膜表面分子的相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞間相互識別等其他因素。本次研究僅初步揭示了CD8+CD127+T細(xì)胞在HIV-1感染中耗竭的部分免疫機(jī)制，后續(xù)我們將從信號通路的角度研究PD-1表達(dá)對CD8+CD127+T細(xì)胞的影響，為HIV-1感染的免疫機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。