陳 敏 張 楠 周 政

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，石河子 832008)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是發(fā)生于口腔鱗狀上皮細(xì)胞覆蓋及其毗鄰部位的一種惡性腫瘤[1]。它是口腔癌的主要類型，約占口腔癌總發(fā)病率的90%，也是在印度發(fā)病率最高的癌癥[2，3]。調(diào)查表明，煙草、酒精、檳榔和人乳頭瘤病毒等是引起OSCC的重要因素[4]。早期OSCC患者多進(jìn)行手術(shù)切除治療預(yù)后良好，晚期OSCC患者經(jīng)手術(shù)、放療化療綜合治療后仍預(yù)后不良，5年生存率約為50%[5]。近年來OSCC的發(fā)病率逐年上升[1]，成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。了解OSCC的發(fā)病機(jī)理是尋找其有效治療方法的重要前提。大量研究表明，非編碼RNA異常表達(dá)是癌癥發(fā)生發(fā)展的潛在標(biāo)志[6-8]。據(jù)報道，長鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Colon cancer associated transcript 1,CCAT1)在OSCC組織中過度表達(dá)并預(yù)示預(yù)后不良[3]。CCAT1是一種促癌因子，在多種癌癥中過度表達(dá)[9-13]。同時，CCAT1可通過誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肺腺癌的轉(zhuǎn)移[13]。在OSCC中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制被過度激活[14]，但目前關(guān)于CCAT1對OSCC細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞侵襲、遷移的影響還沒有被進(jìn)一步研究。本文通過檢測CCAT1在癌旁組織、癌組織及各OSCC細(xì)胞系的表達(dá)，進(jìn)而通過沉默CCAT1，探究其對上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞侵襲、遷移的影響，進(jìn)一步明確CCAT1在OSCC的作用機(jī)理，為尋找治療OSCC的有效方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol、總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量PCR試劑盒、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒來自美國ThermoFisher公司。所用引物及RNA購自北京六合華大基因公司。RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。青霉素-鏈霉素溶液(×100)、CCK8試劑盒、Hoechst染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和T細(xì)胞因子4(T cell factor 4,TCF-4)抗體購自美國Santa Cruz公司。鈣依賴性黏附蛋白E(Calcium-dependent adhesion protein E,E-cadherin)和鈣依賴性黏附蛋白N(N-cadherin)抗體購自美國R&D Systems公司。Snail、β-連環(huán)素(β-catenin)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)抗體購自美國Abcam公司。3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及所有二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2組織及細(xì)胞 正?？谇火つそM織由天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院提供，OSCC組織由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢測確認(rèn)并提供。OSCC細(xì)胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 條件為37℃、5% CO2，細(xì)胞培養(yǎng)液為含有1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。細(xì)胞傳代條件為細(xì)胞融合率≥85%，傳代濃度為1×104個/ml。

1.2.2分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為空白對照(Control)、shRNA 對照(sh-scramble)和sh-CCAT1組。細(xì)胞以0.1×106個/ml的濃度接種于6孔板中。24 h后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟參考轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，轉(zhuǎn)染6 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.3RT-PCR檢測CCAT1的mRNA水平 于通風(fēng)櫥中抽提各檢測樣品總RNA，抽提步驟參考總RNA提取試劑盒說明書。將抽提所得的各樣品總RNA定量分析后，取等量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄步驟參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。PCR儀將cDNA擴(kuò)增后，利用SYBR green實(shí)時定量PCR試劑盒對各樣品進(jìn)行定量分析。CCAT1上游引物序列:5′-AGGGAGTGTC-TAGTTGCAGG-3′,下游引物序列:5′-CACCAGGGAC-CAGTTTTGTG-3′。

1.2.4CCK8檢測SCC9細(xì)胞增殖情況 首先將1.2.2中各組細(xì)胞培養(yǎng)0、1、2、3、4 d，然后根據(jù)CCK8試劑盒說明書，每孔分別加入10 μl CCK8溶液，37℃孵育3 h。于450 nm處檢測各組細(xì)胞吸光度，計算細(xì)胞增殖生長倍數(shù)。

1.2.5Hoechst染色檢測SCC9細(xì)胞凋亡情況 首先將1.2.2中各組細(xì)胞進(jìn)行固定，然后利用Hoechst染色試劑盒進(jìn)行染色，最后利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm的條件下，可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核，染色步驟參考Hoechst染色試劑盒說明書。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SCC9細(xì)胞遷移能力 實(shí)驗(yàn)之前先將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板背面畫橫線，每孔至少有5條橫線且穿過板孔，各橫線間隔0.8 cm左右，橫線需均勻而筆直。然后在板中培養(yǎng)SCC9細(xì)胞，并按1.2.2中分組方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿板孔后，用100 μl中號槍頭盡量垂直于其背面橫線進(jìn)行劃痕。劃痕后用PBS洗滌板孔，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取0和24 h拍照，計算劃痕閉合率。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SCC9細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)之前先將Matrigel放于4℃融化，融化后取少量Matrigel到Transwell小室中進(jìn)行預(yù)包被。將1.2.2中各組細(xì)胞接種于上室并用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后，用棉簽拭去濾膜上層未轉(zhuǎn)移細(xì)胞，HE染色液對下層轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)行染色并計數(shù)。

1.2.8免疫印跡檢測蛋白表達(dá) 首先用RIPA裂解1.2.2中各組細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，然后用BCA試劑盒對蛋白濃度定量并調(diào)平蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用10% SDS-PAGE將蛋白分離，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，最后曝光顯色并以β-actin為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布分析和方差齊性分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，不符合條件的數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1CCAT1在正常口腔黏膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的mRNA水平 與正?？谇火つそM織比較，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中CCAT1的mRNA水平顯著升高(P<0.001，圖1)。提示CCAT1上調(diào)可能與口腔鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。

圖1 RT-PCR檢測正?？谇火つそM織與口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中CCAT1的mRNA水平Fig.1 mRNA level of CCAT1 in normal tissue and oral squamous cell carcinoma tissue were evaluated by RT-PCRNote: n=20,***.P<0.001 vs normal tissue.

2.2CCAT1在口腔角質(zhì)細(xì)胞系和口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系中的mRNA水平 與正?？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞系hNOK比較，口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83中CCAT1的mRNA水平顯著升高(P<0.001，圖2)，本文中選用SCC-9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CCAT1上調(diào)可能與口腔鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。

2.3sh-CCAT1降低SCC-9細(xì)胞中CCAT1的mRNA水平 與Control組比較，sh-scramble組細(xì)胞中CCAT1的mRNA水平無顯著差異，sh-CCAT1組中CCAT1的mRNA水平顯著降低(P<0.001，圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sh-CCAT1可顯著下調(diào)CCAT1。

2.4sh-CCAT1降低SCC-9細(xì)胞增殖速率 與Control組比較，sh-scramble組細(xì)胞增殖速率無顯著差異，sh-CCAT1組細(xì)胞增殖速率顯著下降(P<0.001，圖4)。此外，與Control組比較，sh-scramble組中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)無顯著差異，sh-CCAT1組中PCNA的表達(dá)顯著下降(P<0.001，圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sh-CCAT1可阻礙SCC-9細(xì)胞的增殖。提示CCAT1有利于SCC-9細(xì)胞的增殖。

圖2 RT-PCR檢測hNOK、SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83細(xì)胞系中CCAT1的mRNA水平Fig.2 mRNA level of CCAT1 in hNOK,SCC-4,SCC-9,SCC-25 and Tca83 cell lines were evaluated by RT-PCRNote: n=6,***.P<0.001 vs hNOK cell line.

圖3 RT-PCR檢測sh-CCAT1對CCAT1 mRNA水平的影響Fig.3 Effect of sh-CCAT1 on mRNA level of CCAT1 were evaluated by RT-PCRNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

2.5sh-CCAT1提高SCC-9凋亡細(xì)胞百分比 與Control組比較，sh-scramble組的凋亡細(xì)胞百分比無

圖4 CCK8試劑盒檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of sh-CCAT1 on proliferation in SCC-9 cells were evaluated by CCK8Note: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖5 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞表達(dá)PCNA、MMP-2和VEGF的影響Fig.5 Effect of sh-CCAT1 on expressions of PCNA,MMP-2 and VEGF in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖6 Hoechst染色法檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞凋亡的影響(×400)

Fig.6 Effect of sh-CCAT1 on apoptosis in SCC-9 cells were evaluated by Hoechst staining(×400)

Note:n=6,***.P<0.001 vs control group.

顯著差異，sh-CCAT1組的凋亡細(xì)胞百分比顯著提高(P<0.001，圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sh-CCAT1可促進(jìn)SCC-9細(xì)胞凋亡。提示CCAT1可抑制SCC-9細(xì)胞凋亡。

2.6sh-CCAT1降低SCC-9細(xì)胞劃痕閉合率 與Control組比較，sh-scramble組的細(xì)胞劃痕閉合率無顯著差異，sh-CCAT1組的細(xì)胞劃痕閉合率顯著下降(P<0.001，圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sh-CCAT1可降低SCC-9細(xì)胞的遷移能力。提示CCAT1可提高SCC-9細(xì)胞的遷移能力。

2.7sh-CCAT1減少SCC-9侵襲細(xì)胞數(shù) 與Control組比較，sh-scramble組侵襲細(xì)胞數(shù)無顯著差異，sh-CCAT1組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.001，圖8)。此外，與Control組比較，sh-scramble組中侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-2和VEGF[19,20]的表達(dá)無顯著差異，sh-CCAT1組中MMP-2和VEGF的表達(dá)顯著下降(P<0.001，圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sh-CCAT1可降低SCC-9細(xì)胞的侵襲能力。提示CCAT1可提高SCC-9細(xì)胞的侵襲能力。

圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞遷移的影響(×200)Fig.7 Effect of sh-CCAT1 on migration in SCC-9 cells were evaluated by wound healing assay(×200)Note: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖8 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞侵襲的影響(×400)

Fig.8 Effect of sh-CCAT1 on invasion in SCC-9 cells were evaluated by Transwell assay(×400)

Note:n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖9 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞表達(dá)E-cadherin、N-cadherin和Snail的影響Fig.9 Effect of sh-CCAT1 on expressions of E-cadherin,N-cadherin and Snail in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖10 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞表達(dá)β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的影響Fig.10 Effect of sh-CCAT1 on expressions of β-catenin,TCF4 and Cyclin-D1 in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

2.8sh-CCAT1抑制SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 與Control組比較，sh-scramble組中E-cadherin(上皮標(biāo)記物)、N-cadherin(間質(zhì)標(biāo)記物)和Snail(E-cadherin抑制因子)[21-24]的表達(dá)無顯著差異， sh-CCAT1組中E-cadherin的表達(dá)顯著增加，N-cadherin和Snail的表達(dá)顯著減少(P<0.001，圖9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，sh-CCAT1對SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用。提示CCAT1對SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。

2.9sh-CCAT1抑制SCC-9細(xì)胞Wnt/β-catenin通路激活 與Control組比較，sh-scramble組中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達(dá)無顯著差異，sh-CCAT1組中β-catenin、TCF-4和Cyclin-D1的表達(dá)顯著減少(P<0.001，圖10)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，sh-CCAT1抑制SCC-9細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活。提示CCAT1可促進(jìn)SCC-9細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活。

3 討論

LncRNA是指長度大于200個氨基酸的非編碼RNA，在細(xì)胞中多發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡及存活等過程。近來大量研究表明，LncRNA的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。CCAT1是一種與癌癥有關(guān)的LncRNA，在結(jié)腸癌、胃癌、膽囊癌、肝癌、肺腺癌等多種癌癥中均高度表達(dá)[9-13]。同時，CCAT1也在OSCC組織中高度表達(dá)，并預(yù)示OSCC患者預(yù)后不良[3]。而目前關(guān)于CCAT1在OSCC中作用機(jī)制及其影響還有待進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步探索CCAT1對OSCC的作用機(jī)制及影響，本文首先對CCAT1在OSCC組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并觀察到CCAT1在OSCC組織及細(xì)胞株SCC-4、SCC-9、SCC-25 和Tca83中的mRNA水平顯著升高，且其在SCC-9中的mRNA水平高于其他細(xì)胞株，故選用SCC-9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

作為促癌因子，CCAT1可促進(jìn)多種癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。據(jù)報道，在胰腺癌細(xì)胞中，CCAT1被c-Myc靶向激活并高度表達(dá)，沉默CCAT1表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。也有研究表明，在胃癌細(xì)胞中，CCAT1通過靶向下調(diào)microRNA-219-1提高癌細(xì)胞增殖能力，沉默CCAT1表達(dá)可減少癌細(xì)胞增殖并提高細(xì)胞凋亡水平。在本文中，sh-CCAT1可顯著下調(diào)SCC-9細(xì)胞中CCAT1 mRNA水平，降低SCC-9細(xì)胞增殖速率及相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)，并提高SCC-9凋亡細(xì)胞百分比。PCNA是增殖細(xì)胞核抗原，在DNA復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用，被視為評價細(xì)胞增殖能力的經(jīng)典指標(biāo)[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，沉默CCAT1可顯著抑制SCC-9細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示CCAT1可促進(jìn)OSCC細(xì)胞SCC-9增殖并抑制細(xì)胞凋亡。

侵襲和遷移能力是癌細(xì)胞具有的基本特征，癌細(xì)胞侵襲和遷移是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。研究表明，CCAT1可提高多種癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移。如在甲狀腺癌中，CCAT1通過靶向下調(diào)microRNA-143提高癌細(xì)胞侵襲和遷移能力并發(fā)揮促癌癥轉(zhuǎn)移功能，抑制CCAT1表達(dá)后，microRNA-143顯著上調(diào)且細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低[17]。同時在喉鱗狀細(xì)胞癌中，過度表達(dá)的CCAT1可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。本文利用sh-CCAT1沉默CCAT1后發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，sh-CCAT1組中SCC-9細(xì)胞劃痕閉合率顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)及MMP-2和VEGF的表達(dá)顯著減少。VEGF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，有利于癌細(xì)胞侵襲和遷移，是侵襲和遷移過程中的關(guān)鍵蛋白[19]。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，可促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和血管生成，有利于癌組織浸潤轉(zhuǎn)移[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，沉默CCAT1可顯著降低SCC-9細(xì)胞侵襲和遷移能力。提示CCAT1可提高OSCC細(xì)胞SCC-9侵襲和遷移能力。

研究發(fā)現(xiàn)通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，癌細(xì)胞可獲得較高的侵襲和遷移能力[21,22]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞由上皮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)形態(tài)的現(xiàn)象，其分子水平上主要變化為E-cadherin減少、N-cadherin及Snail增多。其中E-cadherin作為上皮細(xì)胞標(biāo)記物，N-cadherin作為間質(zhì)標(biāo)記物，Snail是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，可抑制E-cadherin表達(dá)、促進(jìn)N-cadherin表達(dá)[23,24]。據(jù)報道，在喉鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌等癌癥中，CCAT1可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13,18,25]。同時研究表明，在OSCC中，CCAT1高度表達(dá)且上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過度激活[3,26]，于是本文在沉默CCAT1后，對上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)與Control組比較，sh-CCAT1組SCC-9細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)顯著提高，N-cadherin和Snail的表達(dá)顯著降低，說明沉默CCAT1對SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用。提示CCAT1可促進(jìn)SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生存在密切聯(lián)系，活化的Wnt/β-catenin信號通路可誘導(dǎo)癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，并在轉(zhuǎn)移過程中介導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲和遷移[27,28]。此外，有報道表明，CCAT1可提高胰腺癌細(xì)胞中Cyclin-D1的表達(dá)[15]。細(xì)胞周期素Cyclin-D1誘導(dǎo)細(xì)胞由G1期過渡至S期，是Wnt/β-catenin的靶基因之一，它的過度表達(dá)可引起細(xì)胞癌變[29]。本文研究發(fā)現(xiàn)，sh-CCAT1可顯著降低SCC-9細(xì)胞中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達(dá)。β-catenin是Wnt通路的調(diào)節(jié)中心，可與TCF形成復(fù)合體，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。TCF4是TCF的一種，可與β-catenin相互結(jié)合，參與Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，沉默CCAT1可抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達(dá)，從而阻礙Wnt/β-catenin信號通路的激活。提示CCAT1可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的激活。這一機(jī)制可能參與誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞SCC-9上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

綜上所述，CCAT1在癌組織及OSCC各細(xì)胞系中高表達(dá)，而沉默CCAT1則可顯著抑制SCC-9細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時，與Control組SCC-9細(xì)胞比較，sh-CCAT1組中SCC-9細(xì)胞侵襲、遷移能力降低且上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制。此外，沉默CCAT1阻礙Wnt/β-catenin信號通路的激活。提示CCAT1可促進(jìn)SCC-9細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，且其可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高SCC-9細(xì)胞侵襲、遷移能力，本研究進(jìn)一步豐富對OSCC發(fā)病機(jī)理的了解，為靶向治療OSCC提供理論基礎(chǔ)。