喬玉寶，樊成奇，唐瑩瑩，田曉清

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學，上海 201306；3.農業(yè)部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海 200090；4.農業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

海洋環(huán)境一般具有高鹽和寡營養(yǎng)等特點，一些局部海區(qū)還具有高壓、低溫和低光照等特征，這些特殊性導致生活在其中的很多生物尤其是微生物在長期的適應性進化過程中可能會產生一些有別于陸地生物的防御體系，從而使得它們成為抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗心血管疾病等藥物先導化合物的重要來源［1］。在新結構海洋天然產物中，海洋真菌和放線菌來源分別占8.5%和3.5%，脊索動物海鞘的次級代謝產物也占到4.7%，它們都是結構新穎的海洋天然產物重要來源［2］。

我國海鞘資源豐富，已記錄的中國沿海海鞘分布在渤海5種、黃海21種、東海24種、南海53種，種類合計有 70余種，其中許多屬種如Hartmeyeria等為我國所特有［3-4］。目前國內海鞘的次級代謝產物研究與國際先進水平還存在一定差距，主要集中在瘤海鞘屬柄海鞘（Styela clava）［5］和短腹海鞘屬星座美洲海鞘（Aplidium constellatum）［6］。中國學者對海鞘共附生微生物的次級代謝產物研究也還處于起步階段，早期文獻報道了香豆素類新結構化合物來源于海鞘的青霉菌［7］；2017年，裴召苓等［8］從中國黃海的威海海域柄海鞘來源放線菌Streptomyces coelicoflavus（HQA809）中分離鑒定了2個吡喃酮類化合物，從菊海鞘（Botryllus schlosseri）來源的Nocardiopsis dassonvillei（HQA404）中分離鑒定了1個吩嗪類化合物和1個苯酚類化合物，其中吩嗪類化合物對鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的MIC值分別為50 μM和25μM，顯示出很好的活性。本課題組前期也進行了不同海鞘化學成分的研究［9-11］以及中國各海區(qū)的海鞘共附生微生物資源的持續(xù)收集和活性次級代謝產物的基礎研究［12］。在此基礎上，本文研究了分離自瘤海鞘屬皺瘤海鞘（S.plicata）和冠瘤海鞘（S.canopus）樣品的共附生真菌Purpureocillium sp.FBZ-1和Penicillium sp.BNG-1的次級代謝產物，以期為今后海鞘共附生微生物代謝產物的相關研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物材料：新鮮海鞘于2015年3月23、24日分別采自廣西北海南汅（冠瘤海鞘）和防城港白龍碼頭（皺瘤海鞘），海水沖洗后立即封裝于無菌管內，冷藏保存運輸至實驗室，海鞘品種由東海水產研究所樊成奇研究員鑒定。

微生物鑒定材料：真菌DNA小劑量快速提取試劑盒（上海生工生物公司）；18S引物（上海美吉生物公司）；PCR擴增體系（康為世紀）。

色譜填料和試劑：HP-20大孔吸附樹脂（Mitsubishi Chemical，Japan）；凝膠 Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech，Sweden）；凝膠 Sephadex G-25（Pharmacia Biotech，Sweden）；預制 GF254 TLC硅膠板（青島海洋化學公司）；液相用乙腈、甲醇（色譜級，Tedia，USA）；其余溶劑均為分析純（AR，上海國藥集團）。

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅固體培養(yǎng)基（葡萄糖10.0 g，蛋白胨 5.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20.0 g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL，陳海水 1 000 mL）［13］；PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）；YPD固體培養(yǎng)基（酵母膏10.0 g，蛋白胨 20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）。用于分離菌株時每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各 30 U·mL-1，pH 6.0～6.5［14］。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器

超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司DL-CJ-INDII型；高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-75KBS型；大型恒溫培養(yǎng)箱：Shanghai Chemstar Instruments Co.，Ltd ATB-032型；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司DHG-9123A型；微生物恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司DHP 9162A型；高速微量離心機：上海生工生物有限公司HICO 21型；PCR儀：杭州朗基科學儀器有限公司AG-22331型；凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司GIS-1600型；超聲儀：上海漢克科學儀器有限公司SK250LH型；旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠RE-2000；顯微鏡：上海光學儀器一廠XSP-44X.9型；半制備 HPLC系統(tǒng)：Shimadazu LC-20AT pump，SIL-20A auto sampler，SPD-M20A PDA detector以及 YMC-Pack ODS-AQ column（250×10 mm，S-5μm，12 nm，常用進樣量 100μL，流速 2.5 mL·min-1）；UV：Shimadzu SPD-M20A PDA detector； ESI-MS：Finnigan LCQ DECA instrument；NMR：Bruker AM-400 spectrometer（TMS內標）；LC-MS：Agilent 1290 HPLC-6224 TOF MS；波譜學技術1H-NMR（400 MHz）、13C-NMR（126 MHz）等。

1.3 共附生微生物的分離和培養(yǎng)

1.3.1 菌株的分離純化

將冠瘤海鞘和皺瘤海鞘樣品在超凈工作臺內剪碎，分別稱取1 g左右海鞘樣品加入到裝有10 mL無菌水的50 mL無菌管中，震蕩混勻后靜置于4℃冰箱過夜。將樣品懸液進行1×10-1、1×10-2、1×10-3的梯度稀釋，每個梯度分別取100μL涂布于孟加拉紅、PDA和YPD固體培養(yǎng)基上，由于菌種的適宜生長環(huán)境是27℃左右，故將培養(yǎng)皿放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)［15］。培養(yǎng)約1～2周后長出菌落，根據顏色、形態(tài)等特征挑取差異較大的菌落，接種至相應新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)分離培養(yǎng)。最終得到的菌株保存于相應的斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱保種。

1.3.2 菌落形態(tài)觀察

由于課題研究真菌的次級代謝產物，根據菌株形態(tài)挑選出疑似真菌純化菌株接種在YPD平板培養(yǎng)基，27℃下倒置培養(yǎng)7～10 d，觀察并記錄菌落大小、顏色、質地、有無分泌物等特征［16］。載玻片上滴一滴清水，刮取少量菌絲體和孢子在清水中分散均勻，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、直徑等特性和孢子的顏色、外形并記錄［17］。

1.3.3 菌株18S rDNA-ITS序列分析

將真菌發(fā)酵液減壓抽濾得菌絲體。取適量菌體，加入液氮充分研磨至粉末狀［18］。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA，并于 -20℃保存?zhèn)溆谩２捎?18S-EF3：TCCTCTAAATGACCRAGTTTG和 18S-EF4：GGAAGGGRTGTATTTATTAG，擴增真菌 18S rDNA-ITS序列。

PCR擴增體系為50μL∶2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物各2μL，模板 DNA 5μL，重蒸水16μL。擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min［19］。取5μL PCR擴增產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，檢測 DNA大小，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。提取的DNA-20℃保存之后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。所測結果在NCBI網站比對，種屬歸類。

1.4 FBZ-1菌株代謝產物分離純化

1.4.1 FBZ-1菌株發(fā)酵

配制兩瓶300 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于500 mL三角瓶中，121℃高溫滅菌30 min，再接入經過活化培養(yǎng)的FBZ-1菌株，20℃、160 r·min-1進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在20°C、160 r·min-1分兩批進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵培養(yǎng)一周，共得到約20 L發(fā)酵液。

1.4.2 FBZ-1化合物的提取分離

菌株FBZ-1的20 L發(fā)酵液經抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分。因菌體和發(fā)酵液極性不一樣，故菌體用甲醇和丙酮超聲提取，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取。菌體置于-80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇（MeOH）超聲破碎，分別提取2次，提取液減壓低溫濃縮除去有機溶劑。將胞內水溶液上Middle Chromatogram Isolated gel（MCI gel），用水洗脫 4個柱體積1 200 mL，再用 MeOH/H2O（10∶90）洗脫900 mL，洗脫液舍棄；繼續(xù)依次用MeOH/H2O（40∶60→60∶40→80∶20→100∶0）梯度洗脫，每梯度洗脫液用量均為1 200 mL。胞外濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1 L，用乙酸乙酯按照1∶1萃取4次，將上層的乙酸乙酯相濃縮后，用40%MeOH超聲震蕩溶解后過MCIgel，也依次用MeOH/H2O（40∶60→60∶40→80∶20→100∶0）對 MCIgel中的濃縮液進行梯度洗脫，每梯度洗脫液用量均為2 500 mL。將胞外、胞內同梯度的洗脫液分別合并，濃縮蒸干，得到 40%Me（3.54 g）、60%Me（1.63 g）、80%Me（0.35 g）和100%Me（1.70 g）4個部位。

最主要的40%Me部分用水溶解后過MCI gel，依次用 MeOH/H2O（10∶90→20∶80→35∶65→50∶50→100∶0）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫 1 L濃縮蒸干得到40%MeI（2.36 g）、40%MeⅡ（3.82 g）、40%MeⅢ（2.70 g）和 40%MeⅣ（1.81 g）。

40%MeI部分過正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH/H2O（6∶1∶0.1→5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫1 L得到40%MeIa和40%MeIb，其中40%MeIa經 HPLC反復進樣制備，分離得到化合物1（4 mg，17.83 min）。流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；7 min 30 s，20%乙腈；8 min，30%乙腈；14 min 30 s，40%乙腈；14 min 42 s，70%乙腈；18 min 30 s，70%乙腈；19 min，15%乙腈。40%MeIb部分經檢測后不做處理。

40%MeⅡ部分用反相RP-18柱色譜，依次用CH3CN/H2O（15∶85→25∶75→60∶40→80∶20→100∶0）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫1L，將洗脫液濃縮蒸干得到40%MeⅡa和40%MeⅡb兩個部分。其中40%MeⅡa部分經HPLC反復進樣制備得到40%MeⅡa1、40%MeⅡa2和其余部分，40%MeⅡa1部分過正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫 500 mL，得到化合物 2（4 mg）；40%MeⅡa2部分經Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用70%乙醇洗脫300 mL得到化合物3（6 mg）和化合物 4（5 mg）。

40%MeⅢ部分經Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，70%無水乙醇洗脫，得到40%MeⅢa、40%MeⅢb、40%MeⅢc 3個部分，其中 40%MeⅢb部分經HPLC反復進樣制備，得到化合物5（12 mg，14.42 min）、化合物 6（12 mg，14.42 min）、化合物 7（3 mg，16.05min）和化合物 8（2 mg，19.26 min）。液相流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，20%乙腈；14 min，25%乙腈；21 min，45%乙腈；21 min 30 s，70%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；25 min，15%乙腈。40%MeⅢc部分經HPLC反復進樣制備，濃縮得到化合物9（5 mg，26.42 min）。流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，20%乙腈；14 min，25%乙腈；24 min，45%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；26 min 30 s，70%乙腈；27 min，15%乙腈。

60%Me部分經薄層層析和HPLC-TOF MS分析未發(fā)現(xiàn)有價值的成分，故不做處理。

80%Me經 MeOH溶解后用粗硅膠（200～300目）拌樣上硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（40∶1→30∶1→20∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫500 mL，得化合物 10（37 mg）。

1.5 BNG-1菌株代謝產物分離純化

1.5.1 BNG-1菌株發(fā)酵

配制300 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于500 mL三角瓶中，高溫滅菌（121℃，30 min），再接入經過活化培養(yǎng)的BNG-1菌株，進行發(fā)酵培養(yǎng)。選取發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20℃、160 r·min-1，5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有約0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在20℃、160 r·min-1條件下進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵24瓶培養(yǎng)一周，兩批共得到36 L發(fā)酵液。第3批和第4批采用無菌的20 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在20℃、100 r·min-1條件下培養(yǎng)兩周，又得到40 L發(fā)酵液。

1.5.2 BNG-1化合物的提取分離

菌株BNG-1的76 L發(fā)酵液經抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分，菌體放在自封袋做好標記置于-80℃冰箱中冷凍待用。胞外濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至5 L左右，由于浸膏較多，采用萃取將化學極性部位分段后再采用柱色譜層析進行分離純化。用乙酸乙酯按1∶1萃取后分成水相和乙酸乙酯相，其中乙酸乙酯相用水（含20%的MeOH）溶解后用石油醚按1∶1萃取4次，下層水相另作處理。將萃取后的石油醚相濃縮蒸干，用石油醚、水以及甲醇等溶劑均難溶，用丙酮溶解后分層，取上清液粗硅膠拌樣過正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH/H2O（5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1→2∶1∶0.1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫500 mL，分成4個部分，分別為 PEI、PEⅡ、PEⅢ和 PEⅣ。其中 PEI過正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫 300 mL，得到 PEIa、PEIb、PEIc 3個部分。PEIa部分過凝膠柱，用乙醇等梯度洗脫，得到PEIa1、PEIa2和PEIa3 3個部分。其中PEIa1經HPLC反復進樣制備得到化合物11（76 mg，16.96 min）和化合物 12（15 mg，26.62 min）。進樣量 60μL，流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，25%乙腈；2 min，25%乙腈；14 min，35%乙腈；25 min，60%乙腈；25 min 30 s，70%乙腈；28 min 30 s，70%乙腈；29 min，25%乙腈。PEIb部分通過正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫300 mL，得化合物13（278 mg）。PEIc部分用氯仿溶解后經正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫300 mL，分別得化合物14（15 mg）和化合物15（10 mg）。

菌體置于-80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇（MeOH）超聲破碎30min，分別提取3次，提取液減壓濃縮得到總浸膏。將浸膏用水/石油醚按1∶1萃取4次，將萃取后的水相與之前胞外的水相合并，減壓濃縮除去殘余的石油醚，過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫3個柱體積，再用 MeOH/H2O（10∶90）洗脫6 L，洗脫液舍棄。繼續(xù)依次用MeOH/H2O（30∶70→60∶40→85∶15→100∶0）梯度洗脫，每個梯度用量分別為6 L，濃縮得到30%Me（53.86 g）、60%Me（48.74 g）和 85%Me（17.88 g）3個部分。

30%Me過反相RP-18柱，先用10%MeOH洗脫900 mL除雜，再依次用20%MeOH、30%MeOH和50%MeOH洗脫，每個梯度洗脫900 mL，減壓濃縮得到 30%MeI（8.28 g）、30%MeⅡ（5.55 g）和 30%MeⅢ（4.69 g）。30%MeI部分用水溶解后過 G-25凝膠柱，用蒸餾水洗脫經HPLC分析檢測后合并濃縮得到30%MeIa和30%MeIb兩個部分。30%MeIa部分用H2O溶解后經HPLC反復進樣制備，依次得到化合物16（3 mg，7.98 min）、化合物 17（20 mg，18.37 min）、化合物18（8 mg，22.09 min）和幾個不純的化合物Ia1、Ia2和Ia3。進樣量40μL，流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，17%乙腈；2 min，17%乙腈；21 min，32%乙腈；22 min，70%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；25 min，17%乙腈。Ia2部分過凝膠柱得化合物19（20 mg）。30%MeIb也經HPLC反復進樣制備，得到化合物化合物20（13 mg，12.43 min）、21（2 mg，14.90 min）和 1個混合物Ib1。進樣量30μL，流動相為乙腈-水（均含 0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，15%乙腈；17 min，25%乙腈；18 min，70%乙腈；20.5 min，70%乙腈；21 min，15%乙腈。Ib1過正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（6∶1→5∶1→4∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫300 mL得到化合物22（10 mg）。

60%Me（48.74 g）部分上正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（16∶1→12∶1→10∶1→8∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫1.5 L，得到60%MeI、60%MeⅡ和60%MeⅢ3部分。其中60%MeI經凝膠柱分離得到MeIa、MeIb、MeIc和MeId 4個部分。其中MeIa部分經HPLC反復進樣制備，得化合物 23（5 mg）、化合物 24（35 mg）。進樣量 40 μL，流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，15%乙腈；26 min，40%乙腈；27 min，80%乙腈；29 min 30 s，80%乙腈；30 min，15%乙腈。

85%Me部分用粗硅膠拌樣上柱，依次用CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1→10∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫1 L得到9個部分，其中85%MeⅢ部分過凝膠柱，得到Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd。Ⅲd經過正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫300 mL得到Ⅲd1，Ⅲd1經凝膠柱分離純化，依次得化合物25（3 mg）、化合物 26（45 mg）。85%MeⅦ部分過正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1→10∶1）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫500 mL，得到Ⅶa、Ⅶb和Ⅶc。Ⅶa部分過凝膠柱得到Ⅶa1、Ⅶa2和Ⅶa3。Ⅶa3部分經HPLC反復進樣制備，得到化合物27（15 mg，7.59 min）和化合物 28（8 mg，9.25 min）。進樣量 50 μL，流動相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，40%乙腈；2 min，40%乙腈；3 min，50%乙腈；15 min，60%乙腈；15 min 30 s，40%乙腈。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 顯微鏡菌絲形態(tài)觀察

參照文獻［20］中的方法將1.3.2中菌株形態(tài)觀察結果記錄如下（放大40倍觀察），鏡檢結果顯示菌株 FBZ-1（圖1-a）、BNG-1（圖1-b）符合真菌的形態(tài)特征。

表1 菌株FBZ-1、BNG-1菌絲體特征［20］Tab.1 M ycelium characters of strains FBZ-1 and BNG-1

2.1.2 測序結果

從這2株海鞘中也分離鑒定了其他共附生微生物，由于課題原因未做測序鑒定。菌株FBZ-1和BNG-1送樣均測序拼接成功。將上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所測結果在NCBI網站比對，種屬歸類如表2。

圖1 菌株 FBZ-1（a）、BNG-1（b）的顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 M icrophotographs of strains FBZ-1（a）and BNG-1（b）colony

從比對結果可以得出，F(xiàn)BZ-1屬于淡紫擬青霉屬，BNG-1屬于青霉屬。

2.2 真菌FBZ-1、BNG-1化合物的結構鑒定

從防城港白龍皺瘤海鞘共附生的淡紫擬青霉FBZ-1和北海南汅的冠瘤海鞘共附生的青霉BNG-1這2株真菌發(fā)酵液中，主要采用萃取和柱層析技術（MCI柱層析、正反相硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備高效液相色譜等）進行次級代謝產物的分離純化，并運用波譜學技術（HPLC TOFMS、1H-NMR、13C-NMR等）和物理化學方法，鑒定了其中28個成分的化學結構。

化合物1：綠色固體。正離子模式的ESI-MS數據：m/z243.0879［M+H］+，265.069 8［M+Na］+，推斷化合物 1對應分子式為C12H10N4O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH2.52（s，3H），2.54（s，3H），7.73（s，1H），7.93（s，1H）。13C-NMR（126 MHz，Pyr）δ 161.30，151.15，146.96，144.03，142.33，139.09，138.27，130.16，128.97（CH），126.43（CH），19.71（CH3），19.18（CH3）。數據與文獻［21］報道一致，因此化合物1鑒定為已知生物堿類化合物lumichrome。

化合物2：熒光黃色無定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.95（t，J=14.8 Hz，3H），1.02（d，J=6.8 Hz，3H），1.43（d，J=6.8 Hz，3H），1.50（m，1H），1.96（m，1H），2.52（m，1H），3.89（m，1H），4.02（m，1H）。數據與文獻［22］報道一致，因此化合物2鑒定為已知化合物環(huán)（異亮氨酸-丙氨酸）。

化合物3：白色固體。正離子模式的ESI-MS數據：m/z 217.0966［M+H］+，433.186 4［2M+H］+，推斷化合物 3對應分子式為C12H12N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH3.07（m，1H），3.43（m，1H），3.97（m，1H），4.42（s，1H），4.61（s，1H），7.04（m，1H），7.13（m，1H），7.32（m，1H），7.48（m，1H）。數據與文獻［23］報道一致，因此化合物3鑒定為已知生物堿類 1，2，3，4-四氫-β-咔啉-3-羧酸。

化合物4：黃色固體。1H-NMR（CD3OD，400MHz）數據如下：δH7.47（m，1H），7.79（m，2H），8.45（m，2H），8.68（d，J=12.0 Hz，1H），9.12（s，1H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物4鑒定為已知生物堿類化合物β-咔啉。

表2 18S rDNA序列與NCBI中已知序列的比對結果Tab.2 18S rDNA sequences com pared w ith known sequences in NCBI

圖2 菌株FBZ-1中化合物1～10的結構Fig.2 Structures of com pounds 1～10 from FBZ-1

化合物5：黃色固體。準分子離子峰為m/z 211.143 8 ［M+H］+，推 斷 分 子 式 為C11H18N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.93（t，J=6.7 Hz，3H），1.08（d，J=4.0 Hz，3H），1.34（m，1H），1.59（m，1H），1.79（m，1H），1.95（m，4H），2.18（m，1H），3.52（m，2H），3.87（d，J=3.2 Hz，1H），4.22（m，1H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物5鑒定為已知化合物環(huán)（異亮氨酸-脯氨酸）。

化合物6：黃色固體。正離子模式的ESI-MS數據：m/z227.138 4［M+H］+，249.120 4［M+Na］+，453.270 0［2M+H］+，475.252 0［2M+Na］+，推斷化合物 6對應分子式為C11H18N2O3。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.98（d，J=4.0 Hz，3H），1.01（d，J=4.4 Hz，3H），1.46（m，1H），1.69（m，1H），2.04（m，3H），2.35（m，1H），3.57（m，2H），4.09（s，1H），4.28（t，J=10.8 Hz，1H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物6鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-羥基脯氨酸）。

化合物7：無色無定型粉末。正離子模式的ESI-MS數據：m/z 211.144 0［M+H］+，233.125 5［M+Na］+，推斷化合物7對應分子式為 C11H18N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.97（m，6H），1.54（m，1H），1.93（m，3H），2.02（m，2H），2.31（m，1H），3.52（m，2H），4.15（m，1H），4.27（m，1H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物7鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-脯氨酸）。

化合物8：淺黃色無定型粉末。正離子模式的ESI-MS數據：m/z 245.128 3［M+H］+，推斷化合物8對應分子式為 C14H16N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH1.24（m，1H），1.82（m，2H），2.10（m，1H），3.18（m，2H），3.39（m，1H），3.56（dd，J=18.8，8.0 Hz，1H），4.09（dd，J=11.2，2.8 Hz，1H），4.46（s，1H），7.27（m，5H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物8鑒定為已知化合物環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）。

化合物9：淡黃色無定型粉末。正離子模式的 ESI-MS數據：m/z 300.169 9［M+H］+，推斷化合物 9對應分子式為 C17H21N3O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.44（d，J=6.8 Hz，3H），0.57（d，J=6.4 Hz，3H），0.96（m，2H），1.06（m，1H），3.08（m，1H），3.45（m，1H），3.55（m，1H），4.24（m，1H），6.96（m，1H），7.06（m，2H），7.30（m，1H），7.58（m，1H）。數據與文獻［25］報道一致，因此化合物9鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-亮氨酸）。

化合物 10：黃褐色無定型粉末。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數據如下：δH0.77（d，J=6.4 Hz，3H），0.82（t，J=6.4 Hz，3H），1.26（m，2H），1.50（m，1H），3.26（m，1H），3.44（m，1H），3.86（m，1H），4.33（s，1H），6.33（s，1H），7.13（m，1H），7.21（m，1H），7.36（m，1H），7.62（m，1H）。數據與文獻［26］報道一致，因此化合物10鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-纈氨酸）。

化合物11：白色油狀。正離子模式的ESIMS數據：m/z 164.110 4［M+H］+，推斷化合物11對應分子式為 C10H13NO。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH1.89（s，1H），2.76（t，J=14.8 Hz，1H），3.37（t，J=14.8 Hz，1H），7.22（m，2H）。數據與文獻［27］報道一致，因此化合物11鑒定為已知芳香胺類化合物N-乙酰苯乙胺。

化合物12：黃色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH1.76（t，J=12.8 Hz，2H），2.61（t，J=15.2 Hz，2H），2.90（t，J=15.2 Hz，2H），3.55（t，J=12.8 Hz，2H），4.13（t，J=12.8 Hz，2H），7.22（m，5H）。13C-NMR（126MHz，MeOD）δ172.75，139.96，127.59（CH×2），127.43（CH×2），125.37（CH），60.57（CH2），57.38（CH2），35.03（CH2），30.75（CH2），30.08（CH2）。數據與文獻［28］報道一致，因此化合物12鑒定為芳香胺類化合物N-（4-羥基）丁酰苯乙胺。

化合物13：黃褐色油狀。正離子模式的ESIMS數據：m/z 105.071 4［M+H］+，122.096 9［M+NH4］+，推斷化合物 13對應分子式為C8H11N。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數據如下：δH2.80（t，J=16.0 Hz，2H），3.10（t，J=15.6 Hz，1H），7.40（m，5H）。數據與文獻［29］報道一致，因此化合物13鑒定為已知芳香胺類化合物苯乙胺。

圖3 菌株BNG-1中化合物11～28的結構Fig.3 Structures of compounds 11～28 from BNG-1

化合物14：淺黃色結晶。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH2.66（t，J=15.2 Hz，2H），3.03（t，J=14.8 Hz，2H），7.03（m，3H），7.31（d，J=8.4 Hz，1H），7.52（d，J=8.0 Hz，1H）。數據與文獻［30］報道一致，因此化合物14鑒定為已知芳香胺類化合物色胺，即吲哚乙胺。

化合物 15：黃色固體。1H-NMR（CDCL3，400 MHz）數據如下：δH2.78（t，J=15.2 Hz，2H），3.12（t，J=14.8 Hz，2H），3.48（s，3H），7.04（s，1H），7.13（t，J=14.4 Hz，1H），7.20（t，J=14.4 Hz，1H），7.36（d，J=8.0 Hz，1H），7.61（d，J=8.0 Hz，1H）。數據與文獻［31］報道一致，因此化合物15鑒定為已知芳香胺類化合物N-甲基色胺。

化合物 16：淡黃色無定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.96（m，3H），2.47（m，1H），2.94（m，1H），3.21（dd，J=17.6，10.0 Hz，1H），4.01（s，1H），4.36（s，1H），6.94（s，1H），7.29（m，5H），8.72（s，1H）。數據與文獻［32］報道一致，因此化合物16鑒定為已知化合物環(huán)（苯丙氨酸-5-甲基-3，4-脫氫脯氨酸）。

化合物 17：褐色無定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH1.73（d，J=6.5 Hz，3H），3.21（m，1H），3.44（m，1H），4.54（m，1H），7.05（m，1H），7.14（m，1H），7.33（m，1H），7.48（m，1H）。13C-NMR（126MHz，MeOD）δ169.45，136.02，128.67，124.82，121.19（CH），118.22（CH），116.70（CH），109.90（CH），103.16，50.96（CH），21.02（CH2），16.11（CH3）。數據與文獻［33］報道一致，因此化合物17鑒定為已知生物堿類化合物 3，4-二氫-3-甲基-β-咔啉-1-酮。

化合物18：淺褐色固體。正離子模式的ESIMS數據：m/z206.0772［M+H］+，推斷化合物18對應分子式為C11H11NO3。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH3.06（m，1H），3.24（m，1H），4.40（m，1H），7.09（t，J=14.0 Hz，1H），7.18（t，J=14.0 Hz，1H），7.23（s，1H），7.42（d，J=8.0 Hz，1H），7.68（d，J=7.2 Hz，1H）。數據與文獻［34］報道一致，因此化合物18鑒定為已知生物堿類化合物2-羥基-3-吲哚丙酸。

化合物 19：黃褐色無定型粉末。1H-NMR（C5D5N，400 MHz）數據如下：δH2.86（m，2H），3.12（m，2H），7.15（d，J=7.8 Hz，1H），7.31（d，J=7.8 Hz，1H）。數據與文獻［35］報道一致，因此化合物19鑒定為已知化合物對羥基苯乙胺。

化合物20：白色無定型粉末。正離子模式的ESI-MS數據：m/z［M+H］+，推斷化合物 20對應分子式為 C16H16N4O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.79（m，1H），2.01（m，1H），3.20（m，1H），3.51（m，1H），4.07（m，1H），4.33（m，1H），7.06（t，J=14.8 Hz，1H），7.06（m，2H），7.43（m，1H），7.66（d，J=8.0 Hz，1H）。數據與文獻［35］報道一致，因此化合物20鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-天冬酰胺）。

化合物21：無色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH3.25（m，1H），3.55（m，1H），4.14（s，1H），7.09（t，J=14.8 Hz，1H），7.18（t，J=15.2 Hz，1H），7.23（s，1H），7.42（d，J=8.0 Hz，1H），7.68（d，J=7.6 Hz，1H）。數據與文獻［36］報道一致，因此化合物21鑒定為已知化合物色氨酸。

化合物22：黃色固體。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數據如下：δH0.98（m，12H），1.2-1.4（m，16H），1.70（m，2H），4.25（m，4H），7.63（m，2H），7.73（m，2H）。數據與文獻［37］報道一致，因此化合物22鑒定為已知化合物鄰苯二甲酸異辛酯。

化合物23：白色結晶。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.92（d，J=6.5 Hz，3H），1.08（d，J=6.5 Hz，3H），1.96（m，3H），2.31（m，1H），2.47（m，1H），3.52（m，2H），4.03（s，1H），4.20（t，J=14.0 Hz，1H）。數據與文獻［24］報道一致，因此化合物23鑒定為已知化合物環(huán)（纈氨酸-脯氨酸）。

化合物 24：白色無定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH0.94（m，6H），1.43（d，J=6.4 Hz，3H），1.60-1.85（m，3H），3.90（m，1H），4.02（m，1H）。數據與文獻［38］報道一致，因此化合物24鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-丙氨酸）。

化合物 25：淺黃色固體。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數據如下：δH6.21（d，J=2.0 Hz，1H），6.34（d，J=2.0 Hz，1H），6.84（d，J=8.8 Hz，2H），7.36（d，J=6.8 Hz，2H），8.06（s，1H）。13C-NMR （126 MHz，MeOD）δ181.13，164.86，162.73，158.60，157.69，153.66（CH），130.25（CH×2），123.62，122.18，115.13（CH×2），105.15，98.99（CH），93.65（CH）。數據與文獻［39］報道一致，因此化合物25鑒定為異黃酮類化合物5，7，4-三羥基異黃酮。

化合物 26：墨綠色無定型粉末。1H-NMR（C5D5N，400 MHz）數據如下：δH2.23（s，3H），2.30（s，3H），3.60（s，6H），7.87（s，1H），8.04（s，1H）。13C-NMR （126MHz，Pyr） δ 162.10，151.84，147.73，144.87，143.09，139.86，139.15，131.05，129.74（CH），127.19（CH），49.69（CH3×2），20.44（CH3），19.86（CH3）。數據與文獻［40］報道一致，因此化合物26鑒定為已知化合物 2，4-N，N-dimethyllumichrome。

化合物27：白色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH6.83（m，4H），6.93（dd，J=11.2，6.4 Hz，1H），7.01（dd，J=8.0，2.0 Hz，1H），7.35（dd，J=12.0，8.8 Hz，1H），8.05（dd，J=12.0，8.8 Hz，1H），8.11（s，1H）。數據與文獻［41］報道一致，因此化合物27鑒定為異黃酮類化合物5，7，3，4-三羥基異黃酮。

化合物28：無色固體。正離子模式的ESIMS數據：m/z 255.0652［M+H］+，推斷化合物28對應分子式為 C15H10O4。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數據如下：δH6.83（d，J=8.4 Hz，3H），6.93（dd，J=11.2，6.4 Hz，1H），7.35（dd，J=14.0，8.8 Hz，2H），8.05（dd，J=14.0，8.8 Hz，1H），8.11（s，1H）。數據與文獻［42］報道一致，因此化合物28鑒定為異黃酮類化合物7，4-二羥基異黃酮。

3 討論與展望

通過對FBZ-1、BNG-1兩株真菌的次級代謝產物多樣性研究，發(fā)現(xiàn)其次代產物種類少且結構單一，主要是芳香胺、生物堿和二酮哌嗪，可能與實驗采用的浸提、發(fā)酵的方案有關，具體原因有待后期進一步驗證。皺瘤海鞘化學成分研究開始較早且比較系統(tǒng)，1989年就報道了在該海鞘中首次發(fā)現(xiàn)的西松烷型二萜類成分 styelolide［43］。從中分離得到的化合物類型包括核苷［35］、甾醇、萜類、神經酰胺［44-46］以及肽類成分 plicatamide［47-48］和 tunichrome sp-1［49］；而從其共附生真菌菌株FBZ-1中分離鑒定的次級代謝產物以環(huán)二肽類居多。冠瘤海鞘化學成分研究目前較少，分離到的主要有混合甾醇、酰胺和酯類物質［50-52］；從其共附生真菌菌株BNG-1中分離到的化合物有辛酯和酰胺類，樣品雖不是采自同一批次同一地點，但通過對比發(fā)現(xiàn)共附生微生物與其宿主代謝產物的化合物類型存在相似性。另外，從菌株BNG-1中還分離到一種人體必需的色氨酸（不能自身合成，只能靠從外界攝取而來）。目前該氨基酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)用途廣泛，既可以穩(wěn)定抑郁癥患者情緒，還可用作食品添加劑或防腐劑使用［53-54］?；衔?6為對羥基苯乙胺，通常作為興奮劑使用，還可以用來緩解偏頭痛以及診斷嗜鉻細胞瘤，其鹽酸鹽是制備降血脂藥苯扎貝特的中間體（intermediate of bezafibrate）［35，55］?；衔?2可能為溶劑引入的增塑劑成分，化合物25、27和28可能為實驗引入的YPD培養(yǎng)基成分，具體原因有待進一步驗證。

研究表明環(huán)二肽類物質具有廣泛的生物活性如抑菌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等方面的重要生理活性和應用價值［56-57］。何培青等［58］從北極海洋細菌Pseudoalteromonas sp.2018中分離鑒定的環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）和環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）對辣椒疫霉（Phytophthora capsici）等多種農作物病原真菌具有抑制作用，且最小抑制濃度為125～500μg·mL-1。從菌株FBZ-1中分離出7種環(huán)二肽類物質，包括環(huán)（脯氨酸-亮氨酸），而淡紫擬青霉（Purpureocillium sp.）對多種植物病原線蟲都具有生物防治作用［59-60］，幾種環(huán)二肽共同作用可能會增強菌株對病原真菌的抑制活性，這可能是該菌株防治農作物病害的主要機理。

由于本研究未產生結構新穎的新化合物，可能是由于本實驗只使用了YPD一種發(fā)酵培養(yǎng)基且培養(yǎng)條件簡單的緣故。具體原因有待進一步研究驗證。周雅琳等［61］曾采用仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫兩種不同的發(fā)酵條件誘導珊瑚共附生真菌產生新的氯代產物，研究表明微生物次級代謝能力是可以通過多種途徑加以調節(jié)的，例如環(huán)境脅迫等。在實驗室培養(yǎng)的條件下，調控特殊結構與功能的次代產物的基因可能不能表達，而只有在特殊環(huán)境中才能應激產生，從而導致代謝通路可能關閉［62］。因此，仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫將是一個有效的誘導途徑，使微生物體內“沉默的基因”表達出來，從而獲得良好活性的化學產物。

后期將進一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件，嘗試使用不同的海洋培養(yǎng)基，擴大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分，以期獲得較為復雜或構型特殊的未知化合物。同時盡量模擬海洋生物原來的生活環(huán)境，讓共附生微生物在寡營養(yǎng)低鹽的仿生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用低溫低光照的培養(yǎng)條件，從而有更多的機會利用氯來合成結構新穎、生理活性好的新次級代謝產物。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)東海主要水產養(yǎng)殖區(qū)海鞘優(yōu)勢種皺瘤海鞘資源單位產量大于200 g·m-2，分布遍及閩北羅源灣至東海最南端的南澳島北部水域，局部的資源單位產量甚至可以達到濕重10 kg·m-2以上，資源較為豐富；同時研究還發(fā)現(xiàn)其化學成分結構類型多變，具有抗腫瘤、抗乙肝病毒等顯著生物活性，提示這些物種具有潛在的重要藥用價值［5］。因此，充分利用這些海鞘類污損生物的資源，深入探究其生物活性成分并規(guī)?；_發(fā)具有藥用價值的海洋新藥具有重要的意義。