趙曉惠，施錦婷，2，張建恒，3，康新宇，丁曉瑋，何培民，3，文欽琳，楊曉倩

（1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2.高知大學(xué)海洋植物學(xué)研究室，日本高知 783-8502；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005）

滸苔（Enteromorpha/Ulva prolifera）原屬于綠藻門，綠藻綱，石莼目，石莼科，滸苔屬（Enteromorpha），近年來國際上根據(jù)分子研究結(jié)果已傾向把滸苔屬歸為石莼屬（Ulva）。它廣泛分布于中、低潮區(qū)的砂礫、巖石、灘涂和石沼海岸中。滸苔藻體含有許多人體必需的營養(yǎng)成分，自古以來即作為食用和藥用植物［1-2］，日本已大規(guī)模養(yǎng)殖，其產(chǎn)品價格在海藻中最高［3］。近十幾年以來，許多國家都受到綠潮災(zāi)害的影響，其已成為全球性的海洋環(huán)境問題［4-5］。2008年，滸苔引發(fā)了我國黃海大規(guī)模綠潮暴發(fā)［6-7］，直接威脅2008年青島奧帆賽舉辦，此后則成為我國黃海年年暴發(fā)綠潮主因［8-9］。目前，滸苔生活史、生理生態(tài)學(xué)、發(fā)育與進化生物學(xué)等關(guān)鍵問題正在深入研究，并且研究重點已開始轉(zhuǎn)向功能基因分析與精細定位及分子遺傳學(xué)等關(guān)鍵問題，因此滸苔染色體制備及核型分析研究越來越重要且十分迫切。

染色體制片和核型分析是研究重要功能基因定位、物種演化與分類、染色體遺傳學(xué)等的重要環(huán)節(jié)［10-11］。由于大型海藻細胞壁結(jié)構(gòu)特殊，采用傳統(tǒng)染色體蘇木精染色制備十分困難，至今僅海帶和紫菜染色體制備和分型比較成功［12-13］。COLL等［14］最早采用釩鐵蘇木精染液對紫菜屬的Porphyra leucosticta染色體核型進行研究，并且通過觀察條斑紫菜（Porphyra yezoensis）和壇紫菜（Porphyra haitanensis）的殼孢子及其第1次和第2次萌發(fā)細胞染色體數(shù)目，才首次確認了紫菜減數(shù)分裂發(fā)生位置［15-16］。周偉等［17］采用蘇木精染色可清晰地看到條斑紫菜和壇紫菜葉狀體細胞分別為3條和5條染色體、絲狀體細胞分別為6條和10條染色體。劉宇等［12］利用酶解-熒光法成功制備海帶染色體，并可清晰辨認和分析核型；王浩東［18］最早嘗試使用蘇木精染色和常規(guī)壓片法進行滸苔染色制備和觀察研究，但滸苔染色體制作效果較差，難以準確進行倍性及核型分析。

為此，本研究借鑒海帶染色體制備方法，采用酶解-熒光法探索滸苔染色體制備方法，通過大量實驗研究出綠藻滸苔染色體制備過程中的3個關(guān)鍵條件，并獲得了滸苔染色體核型清晰圖譜，以期為未來滸苔遺傳特征分析以及滸苔基因定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

本實驗選用材料為滸苔，于2018年5月采自江蘇如東紫菜養(yǎng)殖區(qū)域，滸苔雌、雄配子體和孢子體由經(jīng)典生活史方法進行判定［19］。選擇生長狀態(tài)較好的藻體，在溫度為20℃、光照強度為130～150μmol·m-2·s-1、光照周期為12 L∶12 D條件下，于盛有400 mL VSE培養(yǎng)液［20］的三角瓶中充氣培養(yǎng)，每周更換一次培養(yǎng)基。

1.2 染色體的制備

分別取1 cm生長狀態(tài)良好的滸苔雌、雄配子體及孢子體，用滅菌海水清洗3～5次，放入1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1離心2 min，去除多余水分，加入1 mL質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素［12］振蕩搖勻，于4℃靜置處理，并設(shè)置不同處理時間，分別為 4、8、12、16、20 h，以確定最適處理時間。

取秋水仙素處理的藻體，用去離子水漂洗2～3次，離心得沉淀；加入卡諾固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）充分混勻后，于4℃處理24 h，將藻體細胞固定于有絲分裂中期，后離心得沉淀，用去離子水漂洗3次，離心取沉淀藻體，放入1.5 mL離心管中，加入質(zhì)量濃度都為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶各100μL，充分混勻后放入37℃水浴鍋中酶解4～24 h，設(shè)置不同梯度酶解時間分別為 4、8、12、16、20、24 h，以確定最適宜酶解時間；然后用70%的乙醇終止酶解反應(yīng)，并用蒸餾水將酶解后的藻體漂洗3次，去除乙醇，離心得酶解產(chǎn)物沉淀，加入100μL冰乙酸并充分振蕩混勻，取少量酶解產(chǎn)物，設(shè)置不同高度（10、30、50 cm）進行高位滴片，室溫自然晾干。

1.3 染色體的觀察與核型初步分析

取攜帶有染色體的自然晾干載玻片，避光加15μL DAPI（10μg·mL-1）溶液，蓋上蓋玻片，染色15 min后，在熒光顯微鏡（Leica DM4000B/DFC550，德國）下觀察，將圖片拍照保存。根據(jù)染色體數(shù)目判定標準：統(tǒng)計的細胞數(shù)目應(yīng)在30個以上，其中85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認為是該植物的染色體數(shù)目［21］。取5個典型中期細胞，測量并計算染色體絕對長度、相對長度和總長度及各平均值，計算方法參見李懋學(xué)等［21］的核型分析標準；最后根據(jù)染色體絕對長度，利用Adobe Photoshop軟件按照由大到小順序?qū)G苔細胞染色體進行編號并排序［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理時間對染色體制備的影響

秋水仙素能有效抑制紡錘體的形成，秋水仙素處理時間對染色體分裂相、染色體濃縮程度及染色體形態(tài)有較大影響（圖1）。秋水仙素處理時間表明：若處理時間過短（＜8 h），染色體大部分還處于染色質(zhì)狀態(tài)，難以清晰分辨染色體個體（圖1-A，B）；若處理時間過長（＞16 h），造成染色體縮得過短，成極小的圓點狀，顯示不出染色體之間的差異（圖1-D）；對于處理12 h左右的滸苔細胞，其染色體分裂相較多，染色體濃縮程度適宜，分散均勻，形態(tài)清晰（圖1-C）。

2.2 酶解時間對染色體制備的影響

酶解程度的好壞直接影響到制片染色體的質(zhì)量（圖2），若酶解時間過短（＜16 h）（圖2-A～D），細胞壁酶解不完全，細胞質(zhì)有殘留，細胞分散不均勻，染色體形態(tài)不易觀察；若酶解時間過長（＞20 h）（圖2-F），則染色體被降解，同樣不能清楚觀察染色體形態(tài)；實驗發(fā)現(xiàn)，酶解20 h左右效果最好（圖2-E），能去除細胞壁、細胞膜和多糖物質(zhì)，使細胞分散均勻，染色體呈清晰點狀或棒狀。

圖1 秋水仙素處理時間對滸苔染色體制備的影響Fig.1 Effect of different colchicine preparation time on chromosome preparation

圖2 酶解時間對染色體制備的影響Fig.2 Effect of different enzym atic hydrolysis time on chromosome preparation

2.3 滴片高度對染色體制備的影響

滴片的作用主要是打破細胞外被和核膜，使染色體較好地分散在載玻片上以便于觀察。不同高度進行滴片，能獲得不同的染色體制片效果。結(jié)果顯示，在10 cm左右高度下滴片（圖3-A），染色體背景較模糊，不能使染色體較好的分散，不利于染色體的觀察。當?shù)纹叨葹?0 cm左右時（圖3-B），能有效地分散染色體，獲得較容易觀察的染色體。而當高度大于50 cm（圖3-C）進行滴片，染色體較為分散，很難區(qū)分單個細胞染色體。

2.4 核型初步分析

通過不斷優(yōu)化滸苔染色體制片方法后，獲得清晰的滸苔染色體分裂相，其染色體分散較均勻，形態(tài)較清晰（圖4）。本實驗分別選取80個滸苔雌、雄配子體和孢子體細胞進行染色體數(shù)目的確定，93%（超過85%）的細胞染色體數(shù)目為雌、雄配子體n=9，孢子體2n=18。再按照染色體絕對長度由大到小進行染色體核型的初步分析（圖4-D～F），統(tǒng)計5個中期細胞分裂相，雌性配子體的染色體絕對長度（表1）為1.249～3.490 μm，染色體總長度為21.286μm，平均長度為2.265μm；雄性配子體的染色體絕對長度為1.375～2.875μm，染色體總長度為 18.044μm，平均為2.005μm；雌配子體的染色體長度略大于雄配子體染色體，但他們的相對長度之間沒有顯著性差異。孢子體染色體的絕對長度為1.188～2.125μm，總長度為 26.242μm，平均長度為1.458μm。

圖3 不同高度滴片對染色體制備的影響效果Fig.3 Effect of different drop heights on chromosome preparation

圖4 滸苔雌、雄配子體及孢子體的染色體及其核型分析Fig.4 Chromosome images of the female，male gametophytes and sporophytes of U.prolifera and analysis of karyotypes

表1 滸苔雌、雄配子體及孢子體染色體長度（M eans±SD，n=5）Tab.1 Index of karyotype of U.prolifera

3 討論

雖然目前植物染色體制片技術(shù)已較為成熟，但常規(guī)染色體制片技術(shù)仍存在不足之處［23-24］，而滸苔染色體很小，增加了對其染色體的觀察難度，因此要獲得分散良好且清晰的中期分裂相，需要對影響染色體制備過程的每一個關(guān)鍵因素進行最適范圍摸索。預(yù)處理可破壞和抑制紡錘體中微管的形成，使中期分裂相的數(shù)量增加，促使染色體濃縮變短，利于染色體分散［25-26］?？捎米黝A(yù)處理的藥物很多，如秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉、α-溴萘、冰水等［10］，但不同植物進行預(yù)處理的最佳方式不同。楊玲等［25］利用對二氯苯-α-溴萘混合液預(yù)處理沙田柚根尖制片效果最好；李艷輝等［27］用8-羥基喹啉處理皺葉酸模，染色體制片效果最好；劉宇等［12］和唐歷波等［28］分別以秋水仙素作為預(yù)處理試劑處理海帶和白木香，取得了很好的染色體制片效果。由于滸苔與海帶同屬海藻，本研究選用秋水仙素作為預(yù)處理試劑，通過大量實驗比較了不同濃度秋水仙素以及不同預(yù)處理時間對制片效果的影響，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度對預(yù)處理效果影響不大，但其處理時間對實驗結(jié)果有很大的影響，因此選取質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素［12］，本研究得出的秋水仙素最適預(yù)處理時間為12 h，這樣可以積累大量處于分裂中期的染色體［29-30］。

固定劑可以中止細胞中的酶解反應(yīng)或其他代謝活動，防止抗原丟失或被破壞，并保持細胞原有的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)［26］，本研究所選用的卡諾固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1），目的是為了穩(wěn)定染色體的結(jié)構(gòu)，防止其分解，便于顯微觀察。研究結(jié)果表明，卡諾固定時間對制片效果無顯著影響，但染色體在4℃下處理24 h，固定效果最佳，這與劉宇等［12］制備海帶染色體的條件一致。

解離可以除去細胞間的果膠層并軟化、破壞細胞壁［31］。不同的植物材料，解離液的選擇和解離時間大不相同［32-33］，GILL等［34］用纖維素酶和果膠酶溶解細胞壁；陳瑞陽等［35］提出了酶解去壁低滲的制片方法，制片的染色體分散較好、形態(tài)較平整；劉宇等［12］用秋水仙素多種酶處理獲得清晰的海帶染色體。本研究所選用的解離方法為酶解法，在多種酶的作用下，經(jīng)過酶解和壓片后，分生細胞的原生質(zhì)體從細胞壁中脫離出來，使得染色體周圍不帶細胞質(zhì)或僅有少量細胞質(zhì)，從而得到細胞背景干凈、染色體分散較好的制片效果［10，12，36］。本研究酶解所用的每一種酶都是必不可少的，纖維素酶是一種在分解纖維素時起生物催化作用的酶，可以將纖維素分解為寡糖或單糖；果膠酶是從根霉中提取的，使細胞間的果膠質(zhì)降解；離析酶的主要作用是把細胞從組織內(nèi)分離出來，成為單細胞。酶解程度的好壞直接影響到染色體的質(zhì)量，為了獲得高質(zhì)量的染色體分裂相，本研究通過大量實驗得出最適酶解時間，即質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶，混合酶解20 h所得染色體質(zhì)量最高。

滴片的作用主要是打破細胞外被和核膜，使染色體較好地分散在載玻片上以便于觀察。不同高度滴片能獲得不同的染色體制片效果，本研究發(fā)現(xiàn)，若滴片高度低于30 cm，染色體背景較模糊，不能使細胞較好的分散，不利于染色體的觀察；若滴片高度高于30 cm，則細胞與染色體較為分散，很難區(qū)分單個細胞染色體；只有在30 cm的滴片高度下才能獲得高質(zhì)量的染色體。此外，本實驗選用靈敏度高、特異性的DAPI用于染色體的顯帶，方法簡便，分辨率也很高［37］。DAPI復(fù)合物發(fā)出的熒光為淺藍色，熒光顯微鏡觀察細胞標記的效率高，發(fā)出的熒光更加穩(wěn)定，便于顯微照相［38］。

綜上可知，影響滸苔染色體制片優(yōu)劣的因素有很多，染色體制備過程中的每一步都十分關(guān)鍵。染色體制片的目的就是獲得高質(zhì)量的染色體，為后續(xù)的核型分析和原位雜交等研究提供先決條件。本研究發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素處理12 h，在獲得大量處于分裂中期的染色體的基礎(chǔ)上，用質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶，混合酶解20 h，在30 cm高度下滴片，可以獲得質(zhì)量較高的染色體分裂相，所得滸苔雌、雄配子體染色體均為9條，孢子體的染色體為18條，呈短棒狀或點狀，并按照大小順序?qū)θ旧w的核型進行了初步分析，此結(jié)果為滸苔染色體進行核型分析以及滸苔基因定位研究奠定了基礎(chǔ)，也可為未來滸苔全基因組的進一步分析提供重要依據(jù)。