劉弈彤 ，劉期成 ，李紅娟 ，孔維府 ，閻立江 ，宋煥祿，沙 坤

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái) 264670；2.蓬萊市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，山東蓬萊 265600；3.北京工商大學(xué)，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

揮發(fā)性香氣成分是構(gòu)成葡萄酒質(zhì)量的一個(gè)重要因素，在葡萄酒的風(fēng)格和個(gè)性化方面起主要作用。從香氣來(lái)源方面來(lái)說(shuō)，品種香是葡萄酒差異特征的主要來(lái)源，由于不同品種的葡萄組成成分的差異，構(gòu)成各自品種典型獨(dú)特的香氣。Zhang 等[1]比較研究了中國(guó)赤霞珠、品麗珠、蛇龍珠品種新鮮紅葡萄酒香氣成分。結(jié)果表明，3 種葡萄酒中酸類含量最高，其次是醇類和酯類。蛇龍珠葡萄酒醇類和酯類，與赤霞珠和品麗珠葡萄酒相比，更加多樣化。Tufariello等[2]研究了意大利本土葡萄品種黑曼羅釀制的紅葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分，主要為醇類、酯類、酸類，其次是酮類、醛類、內(nèi)酯，有少量酚類、含硫化合物被檢出。此外，葡萄酒香氣的形成也受到其他因素的影響，諸如葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候條件及土壤、栽培方式、采收成熟度和釀造工藝等[3-5]。

近年來(lái)，隨著色譜、質(zhì)譜等現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，基于揮發(fā)性成分分析的多種技術(shù)方法用于葡萄酒的區(qū)別和分類。電子鼻是一種新興的模擬人工嗅覺(jué)的電子系統(tǒng)，它以特定的傳感器和模式識(shí)別系統(tǒng)快速提供被測(cè)樣品的整體信息，指示樣品的氣味特征，具有客觀、準(zhǔn)確、快捷，重復(fù)性好及無(wú)損等優(yōu)勢(shì)[6]。通過(guò)電子鼻可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同生產(chǎn)年份、品種及產(chǎn)區(qū)的葡萄酒的差異區(qū)分[7-8]。但是該技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)揮發(fā)性化合物的定性和定量。而SPME/GC-MS 技術(shù)的特點(diǎn)是可有效分離單個(gè)揮發(fā)性成分并鑒定其結(jié)構(gòu)，已廣泛應(yīng)用于葡萄酒中的香氣分析[9-11]。進(jìn)一步采用OAV值法可確定每個(gè)化合物對(duì)樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[12-13]。

煙臺(tái)是我國(guó)葡萄酒工業(yè)的發(fā)祥地和最大的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，優(yōu)越的地理和氣候條件塑造了風(fēng)格獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)葡萄酒，成為當(dāng)?shù)靥厣牡乩順?biāo)識(shí)產(chǎn)品。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)的赤霞珠[14]、蛇龍珠葡萄酒的香氣成分[15]，而對(duì)其他新引進(jìn)推廣品種葡萄酒的香氣特征鮮有報(bào)道。本研究擬采用電子鼻和SPME/GC-MS 技術(shù)分析煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)3 個(gè)品種干紅葡萄酒中的揮發(fā)性成分，結(jié)合PCA 分析區(qū)分不同品種葡萄酒間的香氣差異，并引入OAV 值對(duì)各種香氣成分的貢獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究將為葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)、釀酒葡萄品種選育、風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控等奠定重要理論基礎(chǔ)，對(duì)加強(qiáng)地區(qū)特色產(chǎn)品原產(chǎn)地保護(hù)具有重要的社會(huì)意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：實(shí)驗(yàn)選取3 個(gè)品種干紅葡萄酒（西拉、馬瑟蘭和美樂(lè)）樣品來(lái)源于煙臺(tái)蓬萊葡萄酒產(chǎn)區(qū)，每個(gè)品種葡萄酒采集自4 個(gè)不同生產(chǎn)廠家，均為2016年產(chǎn)的原酒，共計(jì)12個(gè)樣品。

試劑及耗材：氯化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純，2-甲基-3-庚酮、C7-C22系列烷烴，美國(guó)Sigma公司。

儀器設(shè)備：PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)，德國(guó)AIRSENSE 公司；7890A-7000B 氣-質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱，美國(guó)J&W Scientific 公司；固相微萃取裝置、50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；XS105電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 電子鼻分析

樣品前處理：稱取1 mL 葡萄酒于20 mL 樣品瓶中，加入9 mL 蒸餾水稀釋，室溫下靜置10 min，至頂空氣體達(dá)到平衡。設(shè)定載氣流速400 mL/min條件下，讓載氣攜帶樣品頂空氣體經(jīng)過(guò)傳感器陣列，與傳感器陣列接觸，產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)。信號(hào)檢測(cè)時(shí)間設(shè)為120 s，清洗時(shí)間設(shè)為120 s，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，采集60 s 時(shí)的數(shù)據(jù)，每個(gè)品種葡萄酒樣品取12個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行PCA分析。

1.2.2 SPME/GC-MS分析

量取10 mL 葡萄酒，放入20 mL 萃取瓶中，加入6 g氯化鈉，密封后置于50 ℃水浴中平衡20 min，然后插入固相萃取進(jìn)樣器，萃取40 min。之后將進(jìn)樣器插入氣質(zhì)聯(lián)用儀，以250 ℃解吸7 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣譜條件：選用DB-WAX 毛細(xì)管柱，程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速度升溫到200 ℃，再以10 ℃/min 的速度升溫到230 ℃，保持3 min，氣化室溫度250 ℃；載氣為He，流速6 mL/min，分流比5∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，掃描范圍m/z 55～500。

化合物的定性通過(guò)保留時(shí)間與NIST2.0 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行鑒定，相似指數(shù)和反相似指數(shù)均大于800 的為鑒定化合物，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)系列烷烴(C7～C22)在相同氣質(zhì)測(cè)定條件下進(jìn)行分析，測(cè)定化合物的保留時(shí)間并計(jì)算保留指數(shù)（Retention Indices，RI）[16]，并與文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行比較來(lái)鑒定化合物。

化合物的定量采用內(nèi)標(biāo)法，以0.41 mg/ mL 的2-甲基-3-庚酮為內(nèi)標(biāo)物，在頂空固相微萃取前加入到樣品中，通過(guò)計(jì)算各檢測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比求得其濃度，計(jì)算公式如下：

1.3 OAV值的計(jì)算

一種風(fēng)味化合物對(duì)于某種食品風(fēng)味的實(shí)際作用，取決于該化合物的風(fēng)味閾值及其在該食品中的含量，常用OAV值來(lái)評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下：

式中：C——香氣物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/L；T——感覺(jué)閾值，μg/L。

在既定條件下：OAV＜1，說(shuō)明該組分對(duì)總體氣味無(wú)實(shí)際作用；OAV＞1，說(shuō)明該組分可能對(duì)總體氣味有直接影響；且在一定范圍內(nèi)，OAV 值越大說(shuō)明該組分對(duì)總體氣味貢獻(xiàn)越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理

電子鼻數(shù)據(jù)PCA 分析使用儀器自帶WINMUSTER 軟件完成。揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0 軟件完成，數(shù)據(jù)間的差異分析采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻分析煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒的香氣差異

采用電子鼻對(duì)煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)3 個(gè)品種干紅葡萄酒樣品的整體香氣差異進(jìn)行比較分析，將3 組樣品的電子鼻傳感器響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。PC1 和PC2 累積方差貢獻(xiàn)率已達(dá)到97.61%。由圖1可以看出，美樂(lè)葡萄酒的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布比較緊密，說(shuō)明不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品間的香氣比較接近，而馬瑟蘭和西拉葡萄酒的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布相對(duì)分散，說(shuō)明不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品間的香氣差異較大。但是從3 組樣品的整體分布來(lái)看，3 組樣品分布在不同的區(qū)域，可以被PC1 和PC2 區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明葡萄品種對(duì)制作的葡萄酒的整體香氣有明顯的影響。

2.2 SPME/GC-MS 分析煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒的揮發(fā)性成分

圖1 3組葡萄酒樣品電子鼻檢測(cè)數(shù)據(jù)PCA分析

采用SPME/GC-MS 技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定和分析了3 個(gè)品種干紅葡萄酒中的揮發(fā)性成分，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 可以看出，總共鑒定出7 類、48 種揮發(fā)性成分，包括22 種酯類、10 種醇類、5 種醛類、4 種酮類、3 種酸類、2 種酚類及2 種芳香烴類。3 組樣品在揮發(fā)性成分的種類上并未有差異，主要表現(xiàn)為化合物含量的差異，除醛類和酮類外，其他各類化合物的總量存在顯著差異（P＜0.05）。3 組樣品在揮發(fā)性成分的組成上也存在差異，在西拉葡萄酒中，醇類（51.01 %）含量最高，其次是酯類（43.94%），再其次是酸類（2.30%），含有微量的醛類（1.27%）、酚類（0.96%）、酮類（0.52%）及芳香烴類（0.01%）；在馬瑟蘭葡萄酒中，酯類（52.18%）含量最高，其次是醇類（38.32 %），再其次是酮類（2.50 %），最后是醛類（2.27 %）、酸類（2.20 %）、酚類（2.09 %）及芳香烴類（0.44 %）；在美樂(lè)葡萄酒中，酯類物質(zhì)含量最高（52.64 %），其次是醇類（41.30 %），再其次是醛類（2.72 %），最后是酸類（2.05%）、酮類（0.77%）、酚類（0.31%）及芳香烴類（0.21%）。上述3個(gè)品種與煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)蛇龍珠葡萄酒相比揮發(fā)性香氣成分組成也存在一定差異，蛇龍珠中含量最高的是酸類、醇類和酯類，它們占總揮發(fā)性香氣成分的99%以上[15]。

表1 煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒揮發(fā)性成分

續(xù)表1 煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒揮發(fā)性成分

酯類是檢測(cè)種類最豐富的化合物，葡萄酒中的酯類產(chǎn)生于酵母或細(xì)菌的代謝及葡萄酒陳釀過(guò)程中[17]。酯類可以賦予葡萄酒果香和花香，是葡萄酒中最重要的香氣物質(zhì)。在酯類總含量上，西拉（2730.89 μg/L）和美樂(lè)（2440.29 μg/L）組要顯著高于馬瑟蘭（1408.09 μg/L）組（P＜0.05）。對(duì)單個(gè)化合物來(lái)說(shuō)，含量較高的是乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯等。

醇類是構(gòu)成葡萄酒酒味特征的基本化合物，這些醇類一部分來(lái)源于葡萄漿果如萜烯醇（4-萜烯醇、α-松油醇、香茅醇等），屬于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其含量因植物品種而有差異[18-19]，另一部分葡萄酒中的高級(jí)醇（如異丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-辛醇、1-壬醇等）則是酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物[20]。本研究檢測(cè)的3組葡萄酒在醇類總含量上存在顯著差異（P＜0.05），順序?yàn)槲骼?170.07 μg/L）＞美樂(lè)（1914.51 μg/L）＞馬瑟蘭（1034.13 μg/L）。對(duì)單個(gè)化合物來(lái)說(shuō)，含量較高的是苯乙醇和1-戊醇，它們分別表現(xiàn)出甜香、玫瑰香和水果、香油味。

本研究檢測(cè)到3 種酸類（己酸、辛酸和癸酸），它們主要產(chǎn)生于發(fā)酵過(guò)程中醛類的氧化，其濃度取決于未發(fā)酵葡萄汁的初始成分及發(fā)酵條件[21]。C6—C10脂肪酸類通常在低質(zhì)量濃度時(shí)表現(xiàn)出奶酪、奶油香氣，而在高質(zhì)量濃度時(shí)會(huì)使葡萄酒帶有酸敗、粗糙的氣味[22]。本研究中3 種酸類的含量均較低，產(chǎn)生不愉快風(fēng)味的影響有限。此外，C6—C10脂肪酸類對(duì)于葡萄酒的香氣平衡起積極作用，因?yàn)樗鼈兛梢砸种婆c其對(duì)應(yīng)乙醇酯類物質(zhì)的降解[23]。

醛類是酒精飲料中常見(jiàn)的香氣成分，該類化合物產(chǎn)生于酒精發(fā)酵過(guò)程中，借助酵母催化由丙酮酸鹽脫羧生成[24]。在醛類總含量上，3 組葡萄酒之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05）。壬醛和糠醛可提供辛辣味，己醛和癸醛呈現(xiàn)青草味，苯甲醛呈現(xiàn)扁桃仁味。

本研究檢測(cè)到5 種酮類（2-（甲酰氧基）-1-苯基-乙酮、3,4,4a,5,6,7-六氫-1,1,4a-三甲基-2（1H）-萘酮、4'-（三氟甲基）苯乙酮及5-丁基-二氫-4-甲基-2（3H）-呋喃酮），在其總含量上3組葡萄酒之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

本研究?jī)H檢測(cè)到兩種酚類（4-乙基-苯酚和2,4-雙（1,1-二甲基乙基）-苯酚），葡萄酒中揮發(fā)性酚類的來(lái)源可能與Brettanomyces 酵母代謝活性有關(guān)[25]，也可能來(lái)自陳釀過(guò)程中橡木溶解的成分[26]。從酚類總含量來(lái)看，西拉和馬瑟蘭組要顯著高于美樂(lè)組（P＜0.05）。4-乙基-苯酚呈現(xiàn)出葡萄汁味，2,4-雙（1,1-二甲基乙基）-苯酚呈現(xiàn)出酚味。

芳香烴類（苯乙烯和1,2-二氫-1,1,6-三甲基-萘）在檢測(cè)樣品中含量較低，從其總含量上看，馬瑟蘭和美樂(lè)組要顯著高于西拉組（P＜0.05）。

2.3 揮發(fā)性成分的PCA分析（圖2、圖3）

將3 個(gè)品種干紅葡萄酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)一步進(jìn)行了PCA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖2 和圖3。PC1 和PC2 分別解釋了總方差的46.71%和22.07%，累積方差貢獻(xiàn)率為68.78%。

圖2 3組葡萄酒樣品在前兩個(gè)主成分上的分布

圖3 各揮發(fā)性成分在前兩個(gè)主成分上的分布

圖2 為各樣品在PC1 和PC2 上的分布，由圖可見(jiàn)，3組樣品分布在不同象限，可以被PC1和PC2區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明3 組樣品在揮發(fā)性成分的組成上有明顯差異，西拉葡萄酒分布在PC1 的正半軸，與馬瑟蘭和美樂(lè)葡萄酒相距較遠(yuǎn)，這與電子鼻分析的結(jié)果是一致的。

圖3 為各揮發(fā)性成分在PC1 和PC2 上的分布，由圖可見(jiàn)，與PC1 高度相關(guān)的化合物主要有乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基-丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、氨基甲酸甲酯、2-呋喃羧酸乙酯、丁二酸二乙酯、異丁醇、1-戊醇、1-己醇、α-松油醇、癸醛、己酸等，它們分布在PC1 的正半軸，結(jié)合圖2 可以看出它們?cè)谖骼咸丫浦泻枯^高；與PC2 高度相關(guān)的化合物主要有乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸異戊酯、水楊酸甲酯、癸酸乙酯、己醛等，它們分布在PC2 的正半軸，結(jié)合圖2 可以看出它們?cè)诿罉?lè)葡萄酒中含量較高。

2.4 OAV 值評(píng)價(jià)煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒的香氣質(zhì)量

采用OAV 值評(píng)價(jià)各香氣成分對(duì)葡萄酒風(fēng)味的實(shí)際貢獻(xiàn)，3 組葡萄酒香氣成分的閾值、OAV 及氣味描述見(jiàn)表1。

由表1可知，3組樣品中鑒定出的OAV＞1的活性香氣成分有8 種，包括2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯及壬醛，說(shuō)明這些成分將對(duì)葡萄酒香氣產(chǎn)生直接影響。其中，辛酸乙酯在3 組葡萄酒中均是OAV 值最高的，且美樂(lè)組要顯著（P＜0.05）高于西拉和馬瑟蘭組，它具有鳳梨香、梨香、花香。其次是壬醛，亦是美樂(lè)組顯著（P＜0.05）高于西拉組和馬瑟蘭組，它具有辛辣味。再其次是己酸乙酯，亦是美樂(lè)組顯著（P＜0.05）高于西拉組和馬瑟蘭組，它具有青蘋果味、果香、草莓香、大茴香味。將8 種活性香氣成分的OAV 值總量進(jìn)行計(jì)算，3種葡萄酒的OAV值排序?yàn)槊罉?lè)（560.83）＞馬瑟蘭（295.57）＞西拉（277.62）。

3 結(jié)論

3.1 電子鼻檢測(cè)技術(shù)結(jié)合PCA 分析可以有效區(qū)分煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)的3種干紅葡萄酒的香氣組成。

3.2 采用SPME/GC-MS 法從3 組葡萄酒中共檢出48 種揮發(fā)性成分，包括22 種酯類、10 種醇類、5 種醛類、4 種酮類、3 種酸類、2 種酚類及2 種芳香烴類。3 組樣品在揮發(fā)性成分的種類上沒(méi)有差異，主要表現(xiàn)為含量的差異，除醛類和酮類外，其他各類化合物的總量存在顯著差異（P＜0.05）。PCA 分析結(jié)果表明，3 組樣品在揮發(fā)性成分的組成上有明顯差異。

3.3 OAV值法共鑒定出8種活性香氣成分（OAV＞1），包括2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯及壬醛，它們對(duì)葡萄酒香氣的形成有直接影響。