楊紅艷 許建麗

摘要：目的? 研究黃連中鹽酸小檗堿的酶法輔助超聲提取工藝，并優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。方法? 采用果膠酶酶解后超聲促提方法提取黃連中的鹽酸小檗堿，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶用量、酶解溫度和酶解pH值為影響因素，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并利用多元線性回歸和二項(xiàng)式回歸建立預(yù)測(cè)模型。結(jié)果? 最佳酶解工藝為酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在該優(yōu)化條件下，鹽酸小檗堿提取率為96.3%，與模型預(yù)測(cè)值（97.0%）相差0.7%。結(jié)論? 采用酶法輔助超聲提取可充分提取出黃連中的鹽酸小檗堿，且利用二項(xiàng)式回歸所建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)性。

關(guān)鍵詞：黃連;鹽酸小檗堿;酶法提取;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：R284.2??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0089-05

Abstract： Objective To study the enzymatic assisted ultrasonic extraction process of berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma; To optimize enzymatic hydrolysis parameters. Methods Berberine hydrochloride was extracted from Coptidis Rhizoma by pectinase enzymatic hydrolysis and ultrasonic extraction. Base on single factor experiments， three factors of enzyme dosage， enzymolysis temperature， and pH value were chosen to optimize the pectinase extraction conditions by central composite design and response surface method. The prediction model was established by multiple linear regression and binomial regression. Results The optimum enzymatic hydrolysis process was as follows： the enzyme dosage 1.33%， the enzymolysis temperature 45.8 ℃， and the pH value 2.68. Under these conditions， the extraction rate of berberine hydrochloride was 96.3%， which was different from the model prediction （97.0%） by 0.7%. Conclusion The method of enzymatic assisted ultrasonic extraction can be used to extract berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma. Meanwhile， the established binomial regression model has better predictability.

Keywords： Coptidis Rhizoma; berberine hydrochloride; enzymatic extraction; central composite design and response surface method

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖，其味苦、寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連主要有效成分是以鹽酸小檗堿為代表的生物堿類化合物，屬于苯并異喹啉類季銨型生物堿，具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗心力衰竭、降血壓、抗腫瘤，以及對(duì)腸道疾病、糖尿病和急性肺損傷的治療作用等[1-3]，用途極為廣泛。因此，如何最大限度從黃連中提取鹽酸小檗堿，從而有效利用資源，具有重要意義。

目前，鹽酸小檗堿的常規(guī)提取主要采用酸水、乙醇為溶媒進(jìn)行回流、冷浸等方法處理[4]，普遍存在提取耗時(shí)較長(zhǎng)、步驟多、消耗溶劑量大、提取效率相對(duì)較低的缺點(diǎn)。近年來，為了提高提取效率，新的強(qiáng)化提取技術(shù)（如微波技術(shù)、酶工程技術(shù)、超聲波技術(shù)等）被廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取[5-6]。其中，酶工程技術(shù)可根據(jù)植物細(xì)胞壁的構(gòu)成特點(diǎn)，利用酶降解細(xì)胞壁的組成成分，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使活性成分充分暴露溶出，從而提高中藥有效成分提取率[7]。而超聲波技術(shù)可利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用等加速植物有效成分進(jìn)入溶劑，提高提取率，縮短提取時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟[8-9]。因此，本研究選擇采用酶法輔助與超聲促提相配合的復(fù)合提取工藝，以期最大限度提取黃連中的鹽酸小檗堿，提高資源利用率。

在工藝優(yōu)選的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法上，目前較多采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)及星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，前兩者在試驗(yàn)處理時(shí)可以取得較佳點(diǎn)，基本可以滿足一般試驗(yàn)的要求，但存在試驗(yàn)精度不夠、選擇的試驗(yàn)取值僅接近最佳取值而無法精確找到最佳點(diǎn)、條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)、不能靈敏考察各因素間的交互作用等缺點(diǎn);而采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、試驗(yàn)精度高、預(yù)測(cè)值精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，常被用于提取工藝優(yōu)化中[10-13]。因此，本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化提取黃連中鹽酸小檗堿的酶解工藝參數(shù)，并建立預(yù)測(cè)模型，確定黃連中鹽酸小檗堿的最佳提取方案。

1? 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-20A紫外檢測(cè)器（日本島津公司），AL 104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），T9雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），DL-480E智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司），GWA-UP1-F超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），KHW-8-8電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

黃連藥材（產(chǎn)地四川），經(jīng)嶺南師范學(xué)院制藥工程系夏敬民教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖;鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201613，純度86.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院;果膠酶（批號(hào)P034901），華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.1.1? 色譜條件

色譜柱為Pgrandsil-STC-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（以磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5）=35∶65，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L。色譜圖見圖1。

2.1.2? 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.7 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（0.371 mg/mL）。

2.1.3? 供試品溶液的制備

取黃連藥材粉末（過24目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率99 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品貯備溶液（0.371 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為7.42、14.84、22.26、29.68、37.10、44.52、51.94 ?g/mL的系列溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，各精密吸取20 ?L注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 044 418.82X+50 893.75（R2=0.999 6），結(jié)果表明鹽酸小檗堿在7.42～51.95 ?g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5? 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20 ?L，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果峰面積RSD=1.43%，表明儀器精密度良好。

2.1.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制備的供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、12 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20 ?L，測(cè)定其峰面積，結(jié)果峰面積RSD=1.51%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批黃連藥材粉末5份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 ?L，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算鹽酸小檗堿含量，計(jì)算得RSD=1.62%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8? 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（54.8 mg/g）的黃連藥材粉末約0.1 g，共9份，每3份分別精密加入相當(dāng)于鹽酸小檗堿含量80%、100%、120%的對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為101.49%，RSD=2.70%，表明該法準(zhǔn)確度高。

2.2? 鹽酸小檗堿提取工藝

稱取黃連藥材粉末2.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入適量蒸餾水（調(diào)節(jié)pH=4.0），加入適量果膠酶，置于35 ℃水浴中恒溫酶解2 h，過濾，收集濾液，將酶解后的黃連藥渣加蒸餾水超聲（功率99 W，頻率40 kHz）提取2次，每次25 min，合并濾液，定容至100 mL，從中精密吸取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。精密吸取樣品溶液20 ?L，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿含量及提取率。鹽酸小檗堿提取率（%）=（C×50×100）÷（2×1000×M）×100%。式中，C為樣品溶液中鹽酸小檗堿含量（?g/mL），M為黃連藥材中鹽酸小檗堿含量（54.8 mg/g）。

2.3? 單因素試驗(yàn)

2.3.1? 酶用量考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，加8倍量蒸餾水（調(diào)節(jié)pH=4.0），調(diào)節(jié)果膠酶用量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%，考察酶用量對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果見圖2。

可以看出，隨著酶用量的增加，提取率逐漸增大，酶用量為1.5%時(shí)提取率達(dá)到最大，此后再增加酶用量，提取率反而下降，這可能是酶達(dá)到飽和后，酶量增加反而抑制了酶促反應(yīng)。故最佳酶用量為1.5%。

2.3.2? 酶解時(shí)間考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水（調(diào)節(jié)pH=4.0），固定酶用量為1.5%，調(diào)節(jié)酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同酶解時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果見圖3。可見，鹽酸小檗堿提取率隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在2.5 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后延長(zhǎng)酶解時(shí)間提取率反而下降，故確定最佳酶解時(shí)間為2.5 h。

2.3.3? 酶解pH值考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共5份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，考察不同的酶解pH值對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果見圖4?？梢?，鹽酸小檗堿提取率隨pH值增大而升高，在pH=3.0時(shí)達(dá)到最大值，隨后再增大pH值，提取率逐漸下降，說明在較低pH值條件下更有利于果膠酶活性的發(fā)揮，故確定最佳酶解pH值為3.0。

2.3.4? 酶解溫度考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共5份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水（調(diào)節(jié)pH=3.0），固定酶用量為1.5%、酶解時(shí)間為2.5 h，調(diào)節(jié)酶解溫度分別為30、35、40、45、50、55 ℃，考察不同的酶解溫度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果見圖5?？梢姡}酸小檗堿提取率在30～40 ℃之間隨酶解溫度升高而增大，高于40 ℃后提取率下降，可能由于溫度過高導(dǎo)致酶活性下降。故最佳酶解溫度為40 ℃。

2.4? 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選酶解工藝

2.4.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素考察基礎(chǔ)上，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)酶解工藝的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，選擇酶用量、酶解溫度和pH值作為考察對(duì)象，采用三因素五水平表進(jìn)行試驗(yàn)，各因素水平編碼值見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.4.2? 模型擬合與方差分析

以鹽酸小檗堿提取率為因變量，酶用量（A）、酶解溫度（B）和酶解pH值（C）為自變量，采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行多元線性、二項(xiàng)式擬合。多元線性回歸方程：Y=36.164+3.489A+0.890B+4.726C（R2=0.556 2，P=0.003 9）;二項(xiàng)式回歸方程：Y=-334.267+23.755A+13.943B+69.381C-1.331AB+0.887AC-1.156BC+10.102A2-0.095B2-3.293C2（R2=0.916 0，P=0.000 3）。結(jié)果表明，多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合模型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但多元線性回歸模型的決定系數(shù)較低，且失擬項(xiàng)較顯著（P=0.024 2），說明該模型擬合不佳，預(yù)測(cè)性較差，因此多元線性模型不合適，選取二項(xiàng)式擬合模型進(jìn)行方差分析。結(jié)果顯示，擬合模型P<0.001，失擬項(xiàng)P=0.238 3，決定系數(shù)大于0.9，表明該模型具有很好的擬合度，可用于分析和預(yù)測(cè)效應(yīng)值。由擬合方程回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的F值和P值可知，三因素對(duì)效應(yīng)值的影響為酶解溫度（B）>酶解pH值（C）>酶用量（A）。一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)B2對(duì)鹽酸小檗堿提取率有顯著影響（P<0.01），見表3。

2.4.3? 效應(yīng)面分析及工藝優(yōu)選

根據(jù)二項(xiàng)式擬合模型繪制三維效應(yīng)面與等高線圖，其中另一個(gè)自變量取中間值，見圖6。由效應(yīng)面曲線可直觀分析各因素交互作用的影響情況，曲面越陡峭、彎曲度越大表明效應(yīng)值對(duì)條件的改變?cè)矫舾?，該因素的交互作用?duì)鹽酸小檗堿提取率的影響就越大?？梢钥闯觯附鉁囟群兔附鈖H值對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響最大，提取率隨酶解溫度升高逐漸增大，隨酶解pH值升高呈先增大后減小的趨勢(shì);酶用量在取值范圍內(nèi)對(duì)提取率的影響不大。通過對(duì)回歸方程分析及優(yōu)化求解，得最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在此條件下鹽酸小檗堿提取率預(yù)測(cè)值為97.0%。

圖6? 各因素對(duì)鹽酸小檗堿提取率影響的效應(yīng)面和等高線圖

2.4.4? 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選出的最佳工藝條件進(jìn)行酶法提取驗(yàn)證試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果鹽酸小檗堿提取率分別為96.4%、96.1%、96.4%，平均提取率為96.3%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值誤差為0.7%，說明本研究建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)性，優(yōu)化得到的酶法提取黃連中鹽酸小檗堿的工藝條件準(zhǔn)確可靠。

3? 討論

本試驗(yàn)研究了酶法提取黃連中鹽酸小檗堿的工藝參數(shù)。前期研究對(duì)超聲促提工藝條件進(jìn)行了篩選，確定工藝條件為以8倍量蒸餾水作為溶媒、超聲提取2次、提取時(shí)間為25 min，并比較酶法與非酶法對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶法能顯著提高鹽酸小檗堿提取率，因此最終確定采用酶法輔助超聲促提方法，并通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取的酶解工藝，得到優(yōu)化后的酶解工藝參數(shù)為：酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、pH值2.68，在此優(yōu)化工藝條件下，黃連中鹽酸小檗堿提取率可達(dá)96.3%，表明采用酶法輔助超聲促提方法可基本將黃連中的鹽酸小檗堿提取完全，可為含有鹽酸小檗堿類成分的藥材資源有效利用提供參考方法及試驗(yàn)依據(jù)。

以酸水或乙醇為溶媒從黃連中提取鹽酸小檗堿，常采用煎煮、回流、冷浸等方法，除存在周期長(zhǎng)、工序多、提取率不高等缺點(diǎn)外，酸水易造成環(huán)境污染，容易腐蝕設(shè)備，而以醇為溶媒溶劑回收操作繁瑣，總體耗時(shí)長(zhǎng)。本研究選擇以水為溶媒，將酶法與超聲技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于黃連中鹽酸小檗堿的提取，與傳統(tǒng)提取方法相比，有效提高了鹽酸小檗堿的提取率，節(jié)約了提取時(shí)間。本研究可為黃連中鹽酸小檗堿的提取提供一種條件溫和、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便的方法。

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