胡煬 虞堅爾 張國棟 黃亦琦 薛征

摘要：目的? 觀察補腎固表顆粒對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響，探討其作用機制。方法? 將60只ICR雄性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、玉屏風組和補腎固表高、中、低劑量組，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，建立免疫抑制動物模型，各給藥組給予相應藥物，連續(xù)28 d。末次給藥后眼球取血，脫頸處死小鼠后無菌取出脾臟，MTT法檢測脾淋巴細胞增殖，LDH法檢測NK細胞活力，ELISA檢測血清白細胞介素-2（IL-2）和干擾素-γ（IFN-γ）水平。結果? 與空白對照組比較，模型組小鼠脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，補腎固表各劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明顯增強（P<0.05，P<0.01，P<0.001），脾臟質量及營養(yǎng)狀況亦有改善。結論? 補腎固表顆粒通過增強免疫低下小鼠脾淋巴細胞轉化和殺傷能力，提高血清IL-2和IFN-γ分泌水平，從而改善機體的免疫功能。

關鍵詞：補腎固表顆粒;白細胞介素-2;干擾素-γ;NK細胞活力;脾淋巴細胞增殖;小鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0052-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Gubiao Granules on the immune function of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide; To explore the mechanism of immune function regulation. Methods Totally sixty ICR male mice were randomly divided into blank control group， model group， Yupingfeng group， Bushen Gubiao Granules high-， medium- and low-dosage groups. Except for the blank control group， the other groups were injected cyclophosphamide 50 mg/（kg·d） intraperitoneally for 3 consecutive days to establish an animal model of immunosuppression. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage for 28 days. After the last administration， the eyeballs were bled; the mice were sacrificed by cervical dislocation; the spleens were aseptically removed. The proliferation of spleen lymphocytes was detected by MTT colorimetry. The killing activity of NK cells was detected by LDH method. Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detected by ELISA. Results Compared with the blank control group， the spleen lymphocyte proliferation， NK cell activity， IL-2 and IFN-γ levels in the model group were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， Bushen Gubiao Granules high-， medium- and low-dosage groups could significantly enhance the proliferation of mouse spleen lymphocytes and NK cell killing activity， and increase serum IL-2 and IFN-γ levels （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The

補腎固表顆粒由補骨脂、黃芪、柴胡、防風、白術、烏梅按1∶2∶1∶1∶1比例制成，具有補腎固表、健脾益肺、和解祛邪功效。原方是虞堅爾教授根據小兒肺腎不足的生理特點創(chuàng)制，臨床主要運用于小兒反復呼吸道感染緩解期的治療，療效顯著，尤其對患兒汗多、食少等癥狀有明顯的改善作用[1]。前期研究發(fā)現，補腎固表方對氫化可的松所致免疫功能低下小鼠免疫指標及血清皮質醇水平均有顯著改善[2]。玉屏風顆粒在兒童呼吸系統(tǒng)疾病中的臨床應用已形成專家共識，在免疫學方面，動物體內體外實驗表明，其可顯著促進小鼠脾細胞增殖，提高地塞米松所致免疫功能低下小鼠模型淋巴細胞活力、抑制淋巴細胞凋亡，增加NK細胞活力[3-5]。本實驗以玉屏風顆粒作為陽性對照，觀察補腎固表顆粒對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）及NK細胞活力，脾淋巴細胞增殖能力的影響，探討其對小鼠免疫功能的調節(jié)作用。

1? 實驗材料

1.1? 動物

雄性健康ICR小鼠60只，SPF級，3～4周齡，體質量18～22 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司公司提供，動物許可證號SOXK（滬）2007-0005。分籠飼養(yǎng)于廈門市醫(yī)藥研究所SPF級動物房，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，通風良好，每日光照12 h，晝夜交替。

1.2? 藥物

補腎固表顆粒，廈門市醫(yī)藥研究所制劑室制備，批號20180425;玉屏風顆粒，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號170918;環(huán)磷酰胺粉末（98%）100 mg，上海麥克林科技有限公司，批號C10196709。

1.3? 主要試劑與儀器

YAC-1小鼠淋巴瘤細胞，上海富祥生物科技有限公司;刀豆蛋白A，Sigma公司，貨號C5275-5MG;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號20180419;乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司;IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒，武漢愛博泰克生物科技有限公司。Nikon倒置顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司;SpectraMax M3全波長酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司;Universal320高速離心機，德國Hettich公司;CO2細胞培養(yǎng)箱，新加坡Esco公司;梅特勒-托利多電子天平。

2? 實驗方法

2.1? 分組及造模

采用隨機數字表法將60只ICR小鼠分為空白對照組、模型組、玉屏風組和補腎固表高、中、低劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠參照文獻[4-5]方法，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，建立免疫抑制動物模型。

2.2? 給藥

于造模結束后次日灌胃給藥，補腎固表高、中、低劑量組給藥劑量分別為36、18、9 g/（kg·d），玉屏風組給藥劑量為2.25 g/（kg·d），空白對照組予等量生理鹽水。給藥體積均為0.5 mL/只，每日1次，連續(xù)28 d。

2.3? 觀察指標及檢測方法

給藥結束后次日，稱取小鼠體質量，摘眼球取血制備血清?？焖俅蜷_腹腔，無菌條件下摘取脾臟，用無菌紙吸干臟器表面血跡，電子天平稱重，記錄，制備脾淋巴細胞懸液。

2.3.1? 脾淋巴細胞增殖能力檢測

MTT法檢測脾淋巴細胞增殖能力。吸取100 μL細胞懸液接種于96孔板，每份樣品設6個復孔，前3個分別加入50 μL刀豆蛋白A（終濃度為5 μg/mL），后3個為對照孔，每孔加入50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束前4 h，取出細胞培養(yǎng)板，嚴格按試劑盒說明書操作，結果以刺激指數（SI）表示。SI=試驗孔OD490值÷對照孔OD490值。

2.3.2? NK細胞活力檢測

LDH法檢測NK細胞活力。取傳代培養(yǎng)24～28 h、生長良好的YAC-1細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，1000 r/min離心5 min。再以10%RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，然后懸浮，調整濃度至1×105/mL。在96孔細胞培養(yǎng)板中，試驗孔加入效應細胞、靶細胞各100 ?L，每份樣品設3個復孔，同時設靶細胞自然釋放孔（100 ?L靶細胞+100 ?L培養(yǎng)液）和最大釋放孔（100 ?L靶細胞+LDH釋放試劑），置37 ℃、5%CO2孵育24 h，培養(yǎng)結束前1 h，從細胞培養(yǎng)箱里取出細胞培養(yǎng)板，在最大釋放孔中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，反復吹打數次混勻，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)結束后，400×g離心5 min。吸取各孔上清120 ?L，置于新96孔板中，同時加入60 ?L新配制的LDH檢測工作液，置于水平搖床，避光反應30 min。于酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度，計算NK細胞活力。結果以殺傷率表示。殺傷率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）÷（細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100%。

2.3.3? 血清白細胞介素-2和干擾素-γ水平檢測

取小鼠血清，ELISA檢測小鼠血清IL-2與IFN-γ水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多重比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? 一般狀況

空白對照組小鼠毛發(fā)光亮，活動靈活，大便棕黑色，干濕適度;模型組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后第3日出現活動減少，食量下降，扎堆明顯，喜抱團，易驚，毛色黯淡，出現陰囊皺縮，炸毛、掉毛現象;給予補腎固表顆粒28 d后小鼠食量逐漸增加，活動增多，扎堆減少，停止掉毛，毛色恢復柔順光亮。

4.2? 補腎固表顆粒對小鼠體質量及脾臟質量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠體質量和脾臟質量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠體質量和脾臟質量明顯增加（P<0.05，P<0.001）。結果見表1。

4.3? 補腎固表顆粒對模型小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠脾淋巴細胞增殖能力顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠脾淋巴細胞增殖能力增強（P<0.05，P<0.01），并接近正常水平。結果見表2。

4.4? 補腎固表顆粒對模型小鼠NK細胞活力的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠NK細胞活力明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠NK細胞活力明顯增強（P<0.05，P<0.01，P<0.001）;與玉屏風組比較，補腎固表中、高劑量組小鼠NK細胞活力明顯增強（P<0.05）。結果見表3。

4.5? 補腎固表顆粒對模型小鼠血清白細胞介素-2和干擾素-γ水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，補腎固表各劑量組小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）;補腎固表中、高劑量組小鼠血清IL-2含量優(yōu)于玉屏風組（P<0.05）。結果見表4。

5? 討論

補腎固表顆粒主要用于反復呼吸道感染緩解期的治療，緩解期多以正虛衛(wèi)表不固為主，治療當以固本為要，補肺固表、健脾溫腎。虞堅爾教授指出補腎實為固衛(wèi)[6]。衛(wèi)氣是行于皮膚、分肉、腠理之間的精微物質，出于脾，功在肺，根于腎。方中補骨脂和黃芪為君藥，共同發(fā)揮溫腎健脾、固表止汗的作用;白術、防風一收一散，使邪去而不傷正;柴胡、黃芩為常用藥對，清熱疏肝、和解祛邪，在反復呼吸道感染緩解期，邪氣尚未完全退去，正虛邪戀，用柴胡、黃芩以和解祛邪;烏梅斂肺止咳之功著。全方補中有清，以補為主，用藥平和，組方精當，專為小兒特殊生理病理特點而設?，F代藥理研究表明，補骨脂在免疫器官、免疫細胞及免疫分子各個方面都有不同的促進或抑制作用，且補骨脂具有耐藥性低、不良反應少、毒副作用小等優(yōu)點[7]。黃芪可促進體液免疫，增強單核巨噬細胞的吞噬能力，刺激T、B淋巴細胞的吞噬，還能促進NK細胞功能。Du等[8]發(fā)現，黃芪多糖在促進T細胞增殖活性的同時誘導CD4+T細胞分泌IL-4、IL-2及IFN-γ。柴胡和黃芩可解熱抗炎、抗病毒[9]。

脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力、IL-2和IFN-γ是反映免疫功能的常用指標。脾臟是人體最主要的免疫器官，在維持機體免疫功能方面發(fā)揮著重要作用，它可以產生漿細胞和淋巴細胞，當抗原侵襲機體時產生免疫應答和免疫效應物質，還能合成干擾素、補體和細胞因子等生物活性物質。淋巴細胞增殖并產生效應淋巴細胞，清除非己抗原，維護機體內環(huán)境的穩(wěn)定，淋巴細胞增殖能力決定了效應淋巴細胞的數量和機體免疫應答反應的強度，反映了機體的細胞免疫狀態(tài)。NK細胞活力代表機體的天然防御功能，其作用范圍遠遠大于殺傷性T細胞，其能殺傷某些病毒感染細胞，而對正常未感染細胞沒有殺傷作用。NK細胞還能調節(jié)B淋巴細胞的分化并分泌IL-2、IFN-γ等。IL-2和IFN-γ是具有廣泛的免疫調節(jié)作用的細胞因子。IL-2主要由T細胞產生，以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應，具有重要的免疫調節(jié)作用。能活化T細胞，促進細胞因子產生，刺激NK細胞增殖，增強NK細胞活力及產生細胞因子。NK細胞和IL-2相互促進，增強機體的免疫功能。IFN-γ產生于CD4+T和CD8+T，可通過促進抗原提呈過程而增強免疫功能。

本研究結果表明，腹腔注射環(huán)磷酰胺能建立穩(wěn)定的免疫低下動物模型，與空白對照組比較，模型小鼠一般狀況稍差，飲食減少，喜抱團，體質量減輕，脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力、血清IL-2和IFN-γ水平均明顯下降，表明小鼠免疫功能降低。灌胃4周后，補腎固表顆粒能明顯增強小鼠脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力（P<0.05），提高血清IL-2和IFN-γ水平（P<0.05，P<0.01），對脾臟質量及營養(yǎng)狀況亦有改善。且補腎固表高劑量組對小鼠體質量、脾臟質量、NK細胞活力及IFN-γ水平均有顯著提高（P<0.01）。補腎固表顆粒對脾臟質量、NK細胞活力及IL-2水平的提高優(yōu)于玉屏風組。我們認為，補腎固表顆粒通過提高血清IL-2、IFN-γ、脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活力，從而增強機體的免疫功能。

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