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        AFP陰性肝癌患者血清miR-451、miR-21與miR-200c的差異表達(dá)及價(jià)值分析

        2019-09-02 02:17:18常琳毛玉蘭黃茂華
        肝臟 2019年8期
        關(guān)鍵詞:良性淋巴結(jié)肝臟

        常琳 毛玉蘭 黃茂華

        AFP陰性肝癌(AFP-negative hepatocellular carcinoma,AFP-NHCC)是一類較為重要的肝癌類型,因其腫塊較小,影像學(xué)檢查易漏診[1]。目前對(duì)于AFP-NHCC的診斷仍然缺乏理想的標(biāo)記物。微小RNA(MicroRNA,miR)是一種非編碼小RNA,其可通過靶向作用3’非翻譯區(qū)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄后翻譯[2-3]。近年已發(fā)現(xiàn)多種miR在HCC患者組織及體液中有差異表達(dá),并有望作為HCC診斷的分子標(biāo)志物[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過比較AFP-NHCC、肝臟良性疾病及健康人群血清miR-451、miR-21與miR-200c水平,旨在尋找更有效的AFP-NHCC生物標(biāo)志物。

        資料與方法

        一、研究對(duì)象

        選取2015年7月至2018年5月在我院經(jīng)病理學(xué)確診AFP-NHCC患者120例,其中Ⅰ-Ⅱ期患者79例,Ⅲ-Ⅳ期患者41例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例,未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移87例。同期收取120例肝臟良性疾病(乙型肝炎78例、肝硬化42例)和120例于我院健康體檢者。本項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

        二、 血清miR-451、miR-21與miR-200c表達(dá)水平的檢測(cè)

        使用促凝采血管收集AFP-NHCC患者和肝臟良性疾病患者接受治療前和健康對(duì)照者入院體檢時(shí)外周血5 mL,分離血清。

        按血清RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行總血清RNA提取,使用莖環(huán)法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。miR-451、miR-21、miR-200c和U6基因熔解曲線峰型單一。

        表1 擴(kuò)增miR-451、miR-21、miR-200c和U6的引物序列

        三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間和多組間比較分別采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析。率的比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。受試者工作特征曲線(ROC)比較各指標(biāo)對(duì)AFP-NHCC的鑒別能力。二元Logistic回歸計(jì)算各指標(biāo)預(yù)測(cè)AFP-NHCC的比值比(OR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、基本資料及血清miR-451、miR-21、miR-200c水平比較

        如表2所示,三組間各基本資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AFP-NHCC患者miR-21水平(10.3±2.3)顯著高于肝臟良性疾病(4.5±0.9)和健康體檢者(4.0±0.5),P<0.05;AFP-NHCC患者miR-451(43.4±5.1)和miR-200c(12.8±0.6)水平顯著低于肝臟良性疾病(miR-451:103.3±10.4;miR-200c:25.8±1.3)和健康體檢者(miR-451:99.8±10.7;miR-200c:24.1±1.2),P<0.05;而肝臟良性疾病和健康體檢者間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        二、AFP-NHCC各指標(biāo)與血清miR-451、miR-21、miR-200c的相關(guān)性

        血清miR-451、miR-21、miR-200c水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(miR-451:r=-0.521,P=0.006;miR-21:r= 0.505,P=0.020;miR-200c:r=-0.486,P=0.023)及TNM分級(jí)(miR-451:r=-0.513,P=0.016;miR-21:r= 0.591,P=0.003;miR-200c:r=-0.539,P=0.007)呈線性關(guān)聯(lián),見表3。

        三、 血清miR-451、miR-21、miR-200c對(duì)AFP-NHCC的鑒別價(jià)值

        在聯(lián)合血清miR-451、miR-21、miR-200c時(shí)區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對(duì)照的靈敏度顯著提高達(dá)到89.3%,見表4和圖2。

        四、 血清miR-451、miR-21、miR-200c對(duì)AFP-NHCC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

        二元logistic回歸指出,血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平是AFP-NHCC發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表5。

        討 論

        miR-451、miR-21和miR-200c是近年研究發(fā)現(xiàn)的在HCC中起重要調(diào)控作用的三個(gè)非編碼RNA。Liu等[6]應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-451模擬物于Hep G2細(xì)胞以上調(diào)Hep G2細(xì)胞中miR-451的表達(dá),發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-451后可顯著抑制Hep G2細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力。Guo等[7]的研究發(fā)現(xiàn),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的Huh7細(xì)胞系,其增殖與遷移能力均顯著提高。Oishi等[8]則發(fā)現(xiàn)miR-200c在HCC患者癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,當(dāng)患者手術(shù)切除癌組織后外周血漿miR-200c水平較術(shù)前顯著升高。機(jī)理研究顯示miR-200c可通過抑制抑癌基因MAD2L1表達(dá)以促進(jìn)HCC的進(jìn)展[9]。前期研究提示,miR-451和miR-200c在HCC中扮演抑癌基因,而miR-21則發(fā)揮促癌基因功能。

        表2 基本資料比較

        表3 AFP-NHCC各指標(biāo)與血清miR-451、miR-21、miR-200c的相關(guān)性分析

        表4 血清miR-451、miR-21、miR-200c對(duì)AFP-NHCC的ROC分析結(jié)果

        A圖為miR-451、miR-21與miR-200c鑒別曲線;B圖為聯(lián)合檢測(cè)曲線

        圖1 血清miR-451、miR-21、miR-200c對(duì)AFP-NHCC鑒別價(jià)值

        注:*為校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素后

        本研究我們通過臨床樣本血清中的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AFP-NHCC患者血清miR-21水平顯著高于肝臟良性疾病和健康對(duì)照,而miR-451和miR-200c水平顯著低于肝臟良性疾病和健康對(duì)照,與前期在HCC中的研究結(jié)果相符[6-9]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平與AFP-NHCC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)相關(guān),且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ-Ⅳ期患者中miR-451和miR-200c降低最顯著,而miR-21升高也最顯著,表明血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c與AFP-NHCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

        ROC分析提示,血清miR-451、miR-21和miR-200c在區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對(duì)照的靈敏度/特異度分別為77.3%/81.9%、80.7%/84.7%和69.2%/67.3%;而聯(lián)合三者后在區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對(duì)照的靈敏度顯著提高,達(dá)到89.3%。二元Logistic回歸在校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素影響后,血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平仍是AFP-NHCC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述研究我們發(fā)現(xiàn),血清miR-451、miR-21和miR-200c在AFP-NHCC鑒別診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中均有一定價(jià)值。然而,本次研究有以下不足:(1)miR-451、miR-21和miR-200c聯(lián)合診斷模型的確切價(jià)值有待大樣本量的前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證;(2)miR-451、miR-21和miR-200c三者雖與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期相關(guān),但由于我們未能獲取患者隨訪數(shù)據(jù),因?yàn)閷?duì)于三者在AFP-NHCC的預(yù)后價(jià)值有待進(jìn)一步探討。

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