李偉建 王振宇 袁天杰 景宏舒 代孟君 彭媛 鄢和新 翟博

生物人工肝(bioartificial liver，BAL)可以暫時(shí)替代肝臟發(fā)揮相應(yīng)的功能。種子細(xì)胞是BAL的核心，目前用于BAL的細(xì)胞有人原代細(xì)胞、C3A、豬肝細(xì)胞、誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞等。但是由于種種原因，BAL臨床推進(jìn)緩慢，因此急需尋找到用于生物人工肝的新種子細(xì)胞。2018年，在前期的小鼠肝前體樣細(xì)胞(HepLPC)可逆轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上通過小分子組合將人原代細(xì)胞轉(zhuǎn)化為前體樣細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)人原代肝細(xì)胞體外快速增殖[1]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)前體樣細(xì)胞進(jìn)行永生化并進(jìn)行功能驗(yàn)證，尋找新的用于生物人工肝治療的細(xì)胞，為臨床生物人工肝治療提供參考。

資料與方法

一、材料與試劑

肝臟組織標(biāo)本來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科患者血管瘤旁組織。DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；N-2 無血清添加劑、100X和B-27 無血清添加劑、50X以及雙抗購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；Trizol和Sybgreen購(gòu)自上海碧云天生物科技公司；FBS購(gòu)自于BI公司；相關(guān)引物合成自上海華津生物。HGF、EGF、Y27632、CHIR99021、A83-01購(gòu)自于美國(guó)TargetMol公司；0.25% T/E購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；Large T抗原慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)人原代細(xì)胞的分離與純化與培養(yǎng) 血管瘤旁切除(1～5 g)正常肝組織，通過改良的兩步膠原酶灌注法分離原代人肝細(xì)胞，熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)純化肝細(xì)胞以排除CD24 +或EpCAM +陽(yáng)性祖細(xì)胞獲得HepLPC[1-2]。將細(xì)胞以0.5～2×104cells/cm2接種在有Matrigel(約0.87 μL/cm2)包被的培養(yǎng)皿上，采用增殖與擴(kuò)增培養(yǎng)基(TEM)培養(yǎng)，接種后6～12 d，用0.25%T/E消化重懸后以1∶3～6的比例傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)基。將1 000個(gè)細(xì)胞接種在6孔Matrigel包被的平板上，用0.25%T/E消化后在指定的天數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(二)永生化的建立 2～3×105cells/孔的濃度接種于用Matrigel鋪板后的6孔板中， 24 h后待細(xì)胞匯合率到達(dá)80%時(shí)開始永生化的建立。MOI=20加入慢病毒Large T antigen(約50 μL/孔)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入8 μg Polybrene增強(qiáng)感染效果。感染8 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染病毒72 h后，以1∶1 000加入腺嘌呤素(puro)至TEM培養(yǎng)進(jìn)一步篩選成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24～48 h后換TEM培養(yǎng)基，并重新傳代至已用Matrigel鋪板的6孔板。細(xì)胞以1∶3的密度穩(wěn)當(dāng)細(xì)胞傳代超過20代的一般認(rèn)為永生化建系成功。永生化建立過程中注意對(duì)細(xì)胞凍存與復(fù)蘇進(jìn)行保種，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(三)細(xì)胞分化 將3×105iHepLPC接種到Matrigel包被好的6孔板中，增殖1～2 d，直至達(dá)到90%以上的細(xì)胞覆率。然后更換為M7分化培養(yǎng)基分化7 d。

(四)實(shí)時(shí)PCR 使用Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA使用7 300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，Sybgreen并以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行內(nèi)部控制計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量。PCR系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)為20 μL體系，95℃ 5 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)后使用機(jī)器默認(rèn)程序進(jìn)行熔解曲線采樣。后按照△△CT方式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個(gè)樣本重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

(五)尿素生成 iHepLPC培養(yǎng)基中加入3 mmol NH4Cl，24 h后吸取細(xì)胞上清，3 000 rpm離心5 min去除沉淀，檢測(cè)細(xì)胞上清中的NH4+的含量，從而判定iHepLPC細(xì)胞的氨清除速率。尿素含量檢測(cè)方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

(六)白蛋白ELISA 細(xì)胞更換培養(yǎng)基后24 h收集上清，3 000 r/min離心5 min去除沉淀，培養(yǎng)液中的白蛋白和AAT分別用人白蛋白ELISA試劑盒和人AAT ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

(七)急性肝衰竭小豬血漿以及對(duì)細(xì)胞的功能反應(yīng) 采用0.5 g/kg氨基半乳糖氨(D-gal)誘導(dǎo)小豬急性肝衰竭，24 h后小豬出現(xiàn)ALF的相關(guān)癥狀與體征，血氨、出凝血以及肝腎功能達(dá)到急性肝衰竭指標(biāo)。取小豬血液，4 500 r/min離心15 min，收集上清作為急性肝衰竭血漿-80℃保存?zhèn)溆谩⒓?xì)胞分化培養(yǎng)基更換成急性肝衰竭血漿，反應(yīng)6 h，計(jì)算細(xì)胞活率，同時(shí)驗(yàn)證細(xì)胞的功能基因以及合成與解毒功能。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用軟件GraphPad Prism 7。數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較使用Student′sttest。使用One-way analysis of variance (ANOVA)進(jìn)行3組及以上的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HepLPC細(xì)胞永生化建立

選取Passage 0～20的細(xì)胞，每間隔10代觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞計(jì)數(shù)，增殖過程中細(xì)胞之間的形態(tài)保持一致，無任何改變，每間隔10代還具有相似的增殖速度，說明永生化細(xì)胞建立成功，見表2。在增殖過程中對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)合成，尿素生成，藥物代謝Alb，AAT，CPS1，CYP3A4等主要肝功能基因做檢測(cè)，每個(gè)代次之間表達(dá)量保持穩(wěn)定。

尿素生成是反應(yīng)器肝細(xì)胞解毒功能的主要指標(biāo)，對(duì)每10代次的細(xì)胞進(jìn)行尿素生成的檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞每個(gè)代次之間的尿素生成保持穩(wěn)定。白蛋白分泌是肝細(xì)胞特有的功能，不同代次之間白蛋白分泌穩(wěn)定。說明Large T永生化保持細(xì)胞的合成與解毒功能也相對(duì)穩(wěn)定。見表3。

二、采用分化培養(yǎng)基M7對(duì)iHepLPC進(jìn)行分化

iHepLPC細(xì)胞建立好后進(jìn)行分化，分化以后肝臟功能基因有了顯著上調(diào)。同時(shí)檢測(cè)了M7分化以后的iHepLPC細(xì)胞的尿素生成，Alb分泌水平，發(fā)現(xiàn)合成與解毒功能有了顯著的提高。見表4。

三、小豬急性肝衰竭血漿對(duì)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

分化后iHepLPC細(xì)胞的活率逐漸降低，6 h后細(xì)胞活率降到50%左右(圖1A)，但是反映細(xì)胞解毒功能的尿素生成不斷增加(圖1B)，同時(shí)Alb分泌水平隨著時(shí)間而不斷增加(圖1C)，這說明分化后iHepLPC對(duì)于肝衰竭血漿不僅具有一定的耐受性還發(fā)揮解毒與合成功能。

表2 不同代次細(xì)胞的增殖能力比較(±s)

表3 不同代次間細(xì)胞功能基因和尿素生成、白蛋白比較(±s)

表4 分化前后功能基因、尿素，白蛋白比較(±s)

圖1急性肝衰竭血漿對(duì)分化后iHepLPC的影響 A：急性肝衰竭血漿對(duì)分化后iHepLPC活率的影響；B：急性肝衰竭血漿對(duì)分化后iHepLPC尿素合成；C：急性肝衰竭血漿對(duì)分化后iHepLPC白蛋白合成分泌變化

討 論

種子細(xì)胞是生物人工肝支持系統(tǒng)的靈魂，細(xì)胞功能的好壞直接關(guān)系到生物人工肝的治療效果。人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系C3A雖然具有蛋白分泌功能，然而它們?nèi)狈δ蛩匮h(huán)的相關(guān)基因，表現(xiàn)出尿素生成和氨清除能力下降[3]。體外肝臟輔助裝置(ELAD)可測(cè)試C3A細(xì)胞的功能，然而，裝載有C3A細(xì)胞的ELAD系統(tǒng)的臨床療效有限，不能顯著延長(zhǎng)患者的生存期[4]。將人原代肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化前體樣細(xì)胞(iHepLPC)可使人原代肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)體外快速多代次的增殖。常見的人肝細(xì)胞永生化的方法有Large T antigen、hTERT、Cre-loxp等[5]。Large T antige抑制pp2A的磷酸酶活性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無限增殖。本研究采用Large T antige對(duì)HepLPC進(jìn)行永生化，對(duì)不同代次的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度、形態(tài)、功能基因以及合成解毒功能保持一致。Large T antige建立的永生化細(xì)胞成熟且穩(wěn)定，獲得尿素生成功能強(qiáng)的細(xì)胞，在后期的BAL應(yīng)用中可以減輕患者肝性腦病的癥狀。

對(duì)于建系好的iHepLPC進(jìn)行分化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞功能可以進(jìn)一步提高，細(xì)胞分化是促進(jìn)成熟，提高功能的又一有效辦法。分化后的細(xì)胞具有更加規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)解毒與合成功能有了顯著提高。值得提出的是，iHepLPC具有極強(qiáng)的尿素生成與氨清除能力，用于BAL可以顯著減輕肝性腦病的癥狀和體征。

細(xì)胞在生物人工肝內(nèi)發(fā)揮需要驗(yàn)證其對(duì)ALF血漿的耐受性以及在ALF血漿中的解毒與合成能力。結(jié)果顯示雖然ALF血漿對(duì)iHepLPC有一定的損傷，但是隨著時(shí)間的變化細(xì)胞在血漿中發(fā)揮一定的解毒與合成功能。

綜上所述，永生化后的iHepLPC不僅可以快速無限增殖還可以在ALF血漿中發(fā)揮解毒與合成功能，其可以成為新的生物人工肝種子細(xì)胞。

iHepLPC在ALF血漿體現(xiàn)一定的治療效果，對(duì)于慢加急性肝衰竭的治療效果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。慢加急性肝衰竭是比較常見的肝衰竭，擴(kuò)大iHepLPCs的應(yīng)用范圍，造福廣大肝衰竭患者[6, 7]。本實(shí)驗(yàn)采用單一的細(xì)胞治療，可以與MSC以及HUVEC共培養(yǎng)提高細(xì)胞功能，驗(yàn)證共培養(yǎng)對(duì)ALF血漿的效果[8]。

iHepLPC在小豬ALF血漿實(shí)驗(yàn)上體現(xiàn)出良好的治療效果，然而機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，接下來需要驗(yàn)證其在急性肝衰竭ALF小豬的治療效果。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證其對(duì)ALF具有一定的治療效果，為臨床試驗(yàn)做準(zhǔn)備。希望新的細(xì)胞源可以為廣大ALF患者帶來福音。