張麗華，劉裕，趙鵬，張婷婷，杜永鵬

作者單位：1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2咸陽市麗彩醫(yī)藥有限公司，陜西 咸陽 712046

化香樹為胡桃科植物，藥用部位為其干燥果序，具有清熱燥濕，消腫散於，止癢殺蟲等功效［1-4］。通過相關(guān)文獻報道和臨床實驗表明，化香樹果序中的多糖成分具有較好的抗氧化活性［5］。

多糖是由10個以上的單糖經(jīng)過糖苷鍵連接而成的糖鏈。它是中藥中普遍存在的一種成分，具備免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤抗癌、降血糖血脂、抗衰老、抗輻射等藥理作用，其中免疫促進作用是最重要的［6］。基于多糖在臨床疾病方面的廣泛應(yīng)用和作為美容食品、化妝品、保健品的有效成分，因而多糖具備較大的開發(fā)利用價值。

但在對提取的多糖進行藥理活性研究時，發(fā)現(xiàn)多糖中蛋白質(zhì)對藥理活性的研究影響較大，因此對得到的粗多糖進行除蛋白處理就非常必要而且關(guān)鍵［7-8］。酶法是以酶為催化劑使多糖溶液中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)從而達到去除蛋白的作用，所以此方法脫蛋白效果較好。同時，由于酶專一性較高，該酶不會與多糖發(fā)生結(jié)合，多糖保留率較高，所以，該法為效果較好的多糖蛋白脫除方法［9-11］。因此，本實驗自2018年1—4月通過對木瓜蛋白酶脫除過程中的酶作用條件進行了重點研究，最終篩選確定了化香樹果序多糖脫蛋白的最佳工藝路線，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化篩選出了其最優(yōu)的蛋白脫除條件，為化香樹果序多糖的進一步應(yīng)用研究做了貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器材料：化香樹果序粗多糖（通過本實驗室制得，含量46.65%），三氯甲烷（AR）、正丁醇（AR）、小牛血清白蛋白（AR）、考馬斯亮藍（AR）、濃硫酸（AR）、木瓜蛋白酶（活力單位＞4萬U/g，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

儀器：HHS恒溫水浴鍋（鞏義予華儀器廠）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-265型紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1蛋白質(zhì)標準曲線的繪制 本實驗采用考馬斯亮藍染色法，此方法的原理是考馬斯亮藍G-250染料在游離狀態(tài)為紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后則呈現(xiàn)藍色，在一定濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度和溶液在595 nm波長下的吸光度呈正比［10］。將100 mg考馬斯亮藍G-250溶解于50 mL 95%乙醇中并攪拌均勻，在向其中加入100 mL 85%（W/V）磷酸溶液，加蒸餾水至1 000 mL刻度線處進行定容。取10 mg牛血清白蛋白加一定的蒸餾水，用容量瓶配制成0.1 mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。取6支具塞試管，分別移入標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制成不同濃度的6管溶液，定容至2 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍G-250顯色劑，充分振蕩混合均勻后靜置顯色2 min，用比色法將空白溶液作為對照組，在波長595 nm處測定各管溶液的吸光度，測定應(yīng)在1 h內(nèi)完成。以牛血清白蛋白含量為x軸，以吸光度為y軸，擬合得標準曲線方程：y＝6.598 6x+0.013 2，R2＝0.998 2，呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2蛋白質(zhì)濃度［10］的測定 準確配制5 mg/mL的多糖溶液，取兩只具塞試管，第一管中加入1.0 mL多糖溶液，在第二管管中加入1.0 mL蒸餾水，并分別取考馬斯亮藍5.0 mL加入兩管中，振蕩搖勻，靜置顯色2 min，在595 nm處以第二管溶液為對照組調(diào)零，測第一管溶液吸光度，根據(jù)上述所得標準曲線求得該多糖中蛋白的濃度C前。蛋白脫除率的計算：

式中：C前：為多糖脫蛋白前蛋白質(zhì)的濃度；C后：為多糖脫蛋白后蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.3化香樹果序多糖保留率計算 應(yīng)用苯酚-硫酸

法［10］測定多糖含量，化香樹果序多糖的保留率計算：

式中：M前：為多糖脫蛋白前多糖的含量；M后：為多糖脫蛋白后多糖的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法響應(yīng)面分析方法［12］是目前經(jīng)常采用的一種試驗設(shè)計方法。通過合理的試驗設(shè)計進行試驗，并對試驗得到的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Design-Expert v7.1.3軟件，進行多元二次回歸方程數(shù)據(jù)擬合，繪制響應(yīng)曲面和等高線圖，分析預(yù)測得到較優(yōu)工藝參數(shù)。Design-Expert v7.1.3軟件是專業(yè)響應(yīng)面分析軟件，能夠大大地減少所需要的實驗次數(shù)，提高實驗效率。響應(yīng)面法相對于正交試驗法，精密度高、預(yù)測值接近真實值，結(jié)果更加合理、可靠。

2 結(jié)果

2.1 木瓜蛋白酶法脫蛋白

2.1.1酶用量 分別將0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到預(yù)先準備好的5支含1 mL化香樹果序粗多糖溶液的試管中，放在水浴鍋中，設(shè)置溫度為50℃，在pH值為7.0條件下，保溫1 h，3 000 r/min離心5 min，傾倒出上層脫蛋白的多糖溶液。實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶用量對蛋白脫除率的影響情況

根據(jù)圖1可知，當(dāng)酶用量增大時，蛋白脫除率隨之而迅速增大；當(dāng)酶用量達到1.5%時，蛋白脫除率達到最大值80%，之后慢慢趨于穩(wěn)定，則說明酶用量為1.5%時蛋白脫除率較佳。

2.1.2酶解時間 將1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到預(yù)先準備好的5支含1 mL化香樹果序粗多糖溶液的試管中，放在50℃水浴鍋中，在pH值為7.0條件下，保溫并依次放置 30、60、90、120、150min，然后以3 000 r/min離心5 min，傾倒出上層脫蛋白的多糖溶液。實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時間對蛋白脫除率的影響情況

由圖2可知，蛋白脫除率隨酶解時間的不斷增大，蛋白脫除率逐漸上升，在90 min時蛋白脫除率到達最大，之后又隨酶解時間的增加而逐漸減小，因此，酶解時間90 min為較佳時間。

2.1.3酶解溫度 將1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到預(yù)先準備好的5支含1 mL化香樹果序粗多糖溶液的試管中，分別放在40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中，在pH值為7.0條件下，保溫放置90 min，然后以3 000 r/min離心5 min，傾倒出上層脫蛋白的多糖溶液。實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對蛋白脫除率的影響

從圖3可以看出，溫度在40℃到60℃之間時，蛋白脫除率隨溫度的升高逐漸增大；當(dāng)達到60℃時，蛋白脫除率達到最大；溫度在60℃到80℃之間又隨溫度的升高而降低。因而，酶解溫度60℃為較佳溫度。

2.1.4pH值 將1.5%（酶底比）的木瓜蛋白酶加入到預(yù)先準備好的5支含1 mL化香樹果序粗多糖溶液的試管中，放在60℃水浴鍋中，分別在pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下，保溫放置90 min，然后以3 000 r/min離心5 min，傾倒出上層脫蛋白的多糖溶液。實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH值對蛋白脫除率的影響

由圖4中可知，當(dāng)在中性環(huán)境時，蛋白脫除效果較好，在酸性和堿性環(huán)境時，蛋白脫除效果較差，因此需在中性環(huán)境條件下對多糖溶液進行酶解處理。

2.2 響應(yīng)面由上述實驗可知，木瓜蛋白酶適宜環(huán)境是中性，因此在進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗時固定pH值為7.0，以蛋白脫除率為指標，使用酶用量、酶解時間、溫度3種因素進行15次試驗。響應(yīng)面因素與水平設(shè)計見表1，響應(yīng)面分析方案見表2。

根據(jù)Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到回歸方程為：

2.2.1響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型 根據(jù)表3的分析結(jié)果可知，通過Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的模型顯著水平遠遠小于0.05（P＜0.000 1），說明該模型是有統(tǒng)計學(xué)意義的，從失擬性檢驗結(jié)果來看，失擬誤差并不顯著（P＝0.094 8），這說明實驗中的未知因素對于試驗結(jié)果影響不大，預(yù)測的回歸模型與實際實驗結(jié)果擬合效果較好。由于預(yù)測模型的R2＝0.997 2，說明蛋白脫除率的實驗值與預(yù)測值之間的存在著良好的一致性，該模型的變異系數(shù)CV＝0.51%＜5%，校正系數(shù)R2Adj＝0.992 3，這說明預(yù)測的模型可以反映響應(yīng)值為99.23%的變化，因此通過回歸方程能夠預(yù)測試驗的最佳工藝。通過表3方差分析結(jié)果可知，各單因素中，影響化香樹果序多糖蛋白脫除率最大的是反應(yīng)溫度，其次是時間，其中最不顯著的是酶的加入量，酶用量與時間之間的交互影響最為顯著。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值

表3 方差分析表

圖5 酶用量和溫度對蛋白脫除率的交互影響

圖6 時間和酶用量對蛋白脫除率的交互影響

圖7 時間和溫度對蛋白脫除率的交互影響

2.2.2響應(yīng)面圖分析 根據(jù)圖5～7分析可知：酶解溫度對蛋白脫除效果的影響較大，曲線變化趨勢較陡；而酶解時間和酶用量對蛋白脫除效果的影響較小，曲線變化趨勢平緩。對回歸模型方程求一階偏導(dǎo)：X1＝0.016，X2＝0.951，X3＝0.23［13-14］，然后將三個數(shù)值帶入回歸方程，則可計算得到：在酶用量1.508%，酶解溫度64.76℃，酶解時間92.3 min時，蛋白脫除率為90.82%。

2.2.3優(yōu)化條件重復(fù)驗證試驗 為了便于實驗，將脫蛋白的條件設(shè)定為：酶用量1.508%，溫度65℃，酶解時間92.3 min，pH＝7.0進行3次重復(fù)驗證試驗，試驗結(jié)果如表4所示。

表4 驗證試驗結(jié)果/%

從表4可以看出，蛋白脫除率和多糖保留率在酶用量1.508%，酶解溫度64.76℃，酶解時間92.3 min條件下均較高，化香樹果序多糖脫蛋白試驗重現(xiàn)性較高。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，多糖中的蛋白往往會影響到多糖的活性，其是以結(jié)合或者游離態(tài)存在，對多糖的脫蛋白純化工作，均是為了去游離蛋白質(zhì)而不破壞結(jié)合蛋白質(zhì)，所以確定脫蛋白工藝路線時，一方面要盡可能得除去游離蛋白質(zhì)，另一方面也要盡可能地減少多糖-蛋白質(zhì)類復(fù)合物、多糖大分子的降解。目前應(yīng)用較多的脫蛋白工藝是反復(fù)應(yīng)用Sevage法，該工藝最大的缺點就是多糖保留率低、費時和溶劑量大；也有人采用三氯乙酸和鹽酸法等工藝，其蛋白脫除率很高，但多糖在酸性環(huán)境下容易發(fā)生降解，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。相對而言酶法脫蛋白工藝具有條件溫和，蛋白脫除率較高等優(yōu)點引起了研究者的興趣。本研究經(jīng)過對比上述幾種多糖蛋白的脫除工藝之后，最終選擇應(yīng)用木瓜蛋白酶工藝，并通過響應(yīng)面法確定了其最佳脫蛋白條件為：在酶用量1.508%，溫度65℃，酶解時間92.3 min，pH＝7.0的條件下，化香樹果序多糖蛋白脫除率是90.90%，多糖保留率是84.06%。對進一步加深對化香樹果序多糖的研究具有一定的意義。