何濤，胡洪，謝楠，錢程，胡明，張楚悅，柯恬恬，李春滿，付必莽，蘇瑩珍

作者單位：1玉溪市人民醫(yī)院胃腸外科，云南 玉溪 653100；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，a肝膽胰外科，b麻醉科，云南 昆明 650101；3昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生教研室，云南 昆明 650214

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）惡性程度極高，發(fā)現(xiàn)較晚，即使手術(shù)根治性切除，多數(shù)病人預(yù)后5年生存率仍不足20%［1］。B7-H4是免疫共刺激信號通路的關(guān)鍵分子之一，主要功能為負(fù)性共刺激分子，可參與細(xì)胞的周期調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡以及影響細(xì)胞侵襲力等腫瘤發(fā)生的多個(gè)環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4蛋白在正常組織中不表達(dá)或者微量表達(dá)，但在多個(gè)腫瘤中呈高表達(dá)，同時(shí)其mRNA可在多個(gè)正常組織中被檢測到［1-3］。我們前期在肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）的研究中，發(fā)現(xiàn)B7-H4與ICC的形成和細(xì)胞侵襲過程有關(guān)，且B7-H4表達(dá)與腫瘤分級密切相關(guān)，可作為ICC復(fù)發(fā)早期的診斷靶分子；B7-H4異常表達(dá)能夠促進(jìn)ICC細(xì)胞的體外腫瘤形成能力［2］。以上研究結(jié)果均提示B7-H4可能具有促癌基因的功能，但其與肝癌的關(guān)系尚不明確。因此，本研究結(jié)合免疫組織化學(xué)染色及細(xì)胞慢病毒抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，為此特別挑選惡性程度較高的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行篩選，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)，篩選出部分高表達(dá)B7-H4細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，以期通過體外抑制B7-H4基因的表達(dá)，并分析抑制后對上述肝癌細(xì)胞在侵襲、遷移等能力上的可能影響作用。現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果分析并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料收集2013年8月至2019年1月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的肝癌病人的肝癌組織32例。人肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7購自中科院昆明細(xì)胞庫；PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3肝癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及GAPDH單克隆抗體購自昆明貝爾吉生物公司；Trizol試劑和慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene購自上海翊圣生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物、慢病毒載體設(shè)計(jì)合成與驗(yàn)證均由北京安必奇生物科技有限公司完成；細(xì)胞裂解液（RIPA）、胰酶消化液和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗單克隆抗體，購自美國BD公司；ECL成像系統(tǒng)，由上海天能科技有限公司提供；Transwell小室購自于美國Corning公司。

1.2免疫組織化學(xué)染色（1）取材及病理：將32例肝癌術(shù)后肝癌組織標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成蠟塊。（2）免疫組化方法：石蠟切片脫蠟和水化，修復(fù)抗原，滴加封閉液。加滴B7-H4一抗液，4℃過夜。再PBS沖洗3次，滴加二抗，PBS沖洗3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。每次實(shí)驗(yàn)均做陽性與陰性對照，陽性細(xì)胞質(zhì)著色為棕黃色，每例均設(shè)有HE切片作對照觀察。（3）免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲法觀察切片，B7-H4免疫組化在細(xì)胞膜上染黃色或褐色。實(shí)驗(yàn)樣本根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色比例獨(dú)立評分。根據(jù)被染色細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例進(jìn)行評分即1%～25%，25%～50%，50%～75%和＞75%分別評分為0、1、2、3和4分。該細(xì)胞染色的強(qiáng)度由顏色程度來確定，即無、弱、中、強(qiáng)評分分別為0、1、2和3分。每個(gè)病人綜合得分為0～7分，將B7-H4低組的分?jǐn)?shù)定為≤3分，B7-H4高組得分＞3分。

1.3肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選及沉默HCCLM3、SMMC-7721、Huh-7三種肝癌細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，余下細(xì)胞均使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在適宜條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分瓶培養(yǎng)在6孔板中待細(xì)胞融合率為70%～80%時(shí)，收取蛋白利用WB法，篩選B7-H4各細(xì)胞表達(dá)量。同時(shí)將細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法分組轉(zhuǎn)染慢病毒，分別為對照組、shRNA-1抑制組、shRNA-2抑制組。培養(yǎng)篩選后的各組細(xì)胞并觀察細(xì)胞狀態(tài)，分別實(shí)施轉(zhuǎn)染操作。shRNA-1序列：5′-GCTAATGACAGAGAGAGGATC-3′，shRNA-2序列：5′-GAACGTCAGTGTAGAGTATGA-3′。shRNA-1組、shRNA-2組分別轉(zhuǎn)染上述對應(yīng)抑制序列，對照組只加轉(zhuǎn)染試劑。具體過程：（1）培養(yǎng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×105/孔在24孔板中培養(yǎng)，并最終達(dá)到2×105/孔；（2）配置polybrene轉(zhuǎn)染液，使其終濃度達(dá)到6 μg/mL，轉(zhuǎn)染時(shí)先用polybrene替換原培養(yǎng)基，加入目的基因病毒懸液，繼續(xù)培養(yǎng)；（3）6 h后，加入1.5 mL新鮮培養(yǎng)基；（4）繼續(xù)培養(yǎng)1 d，并用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；（5）轉(zhuǎn)染至2 d后進(jìn)行熒光觀察，并收集轉(zhuǎn)染熒光最強(qiáng)時(shí)的各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.4WB法及RT-PCR法檢測B7-H4抑制效率取上述各組細(xì)胞并提取蛋白，同時(shí)行蛋白定量。加蛋白上樣緩沖液混勻，沸水加熱變性。配置WB膠版并上樣，每孔約30 μg，110 V恒壓電泳，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜。PVDF膜于TBS-T液漂洗10 s，脫脂牛奶封閉1 h，孵育目的抗體和內(nèi)參，4℃孵育過夜。第二日TBS洗膜3次，TBS-T洗膜1次，加入二抗，室溫孵育1 h，再次分別洗膜，曝光條帶分析結(jié)果，篩選最適宜細(xì)胞HCCLM3進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

1.5細(xì)胞侵襲及遷移能力分別采用Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，Transwell小室放置于預(yù)先制備好Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，按上述條件培養(yǎng)箱中過夜，向Transwell小室下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè)）加至Transwell的上室。48 h后去除下室中的培養(yǎng)液，將小室置于4%的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液（0.1%）染色10 min，PBS緩沖液漂洗后，顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)并分析。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，在6孔板中培養(yǎng)前述肝癌細(xì)胞，將細(xì)胞在無血清中持續(xù)饑餓24 h后使用移液槍頭進(jìn)行劃傷，再用PBS洗滌，在0、24、48 h使用相差顯微鏡進(jìn)行拍照。隨后通過手動計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞抑制率的測定，相關(guān)結(jié)果用百分比表示，上述所有實(shí)驗(yàn)均常規(guī)進(jìn)行3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝癌中B7-H4表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性32例肝癌組織中，有14例被染色，染色陽性率為43.75%，其中，強(qiáng)陽性8例，中等及弱陽性6例，同時(shí)，該研究中有5例肝癌復(fù)發(fā)病人。表1的結(jié)果表明，腫瘤的BCLC分期等和B7-H4的表達(dá)密切相關(guān)（P＝0.013）。B7-H4在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，肝癌中B7-H4表達(dá)越高，病人術(shù)后越容易復(fù)發(fā)，見圖1。

圖1 肝癌病人中的B7-H4表達(dá)情況，可見B7-H4表達(dá)越高越容易復(fù)發(fā)（A為免疫組織化學(xué)×200；B為免疫組織化學(xué)×400）

2.2HCC細(xì)胞篩選B7-H4的表達(dá)量上述各組肝癌細(xì)胞的B7-H4相對表達(dá)量見圖2，從結(jié)果可見HCCLM3和PLC/PRF/5兩株細(xì)胞B7-H4表達(dá)量較高。

2.3慢病毒載體抑制細(xì)胞B7-H4表達(dá)情況HCCLM3的WesternBlot相對表達(dá)量：對照組（5.32±1.03）、shRNA-1組（1.42±0.29）、shRNA-2組（2.06±0.68），而PT-PCR結(jié)果：對照組（7.21±0.38）、shRNA-1組（1.71±0.25）、shRNA-2組（2.27±0.38）。PLC/PRF/5組與HCCLM3組結(jié)果相似。shRNA-1組、shRNA-2組均被抑制，shRNA-1組抑制明顯（P＜0.05）。見圖3～6。

表1 32例肝癌中B7-H4表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性/例

圖2 不同肝癌細(xì)胞系中的B7-H4表達(dá)情況

圖3 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制（WB）

圖4 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制（RT-PCR）

圖5 肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制（WB）

圖6 肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制（RT-PCR）

2.4慢病毒載體抑制B7-H4表達(dá)對HCCLM3和PLC/PRF/5細(xì)胞侵襲能力的影響HCCLM3對照組的細(xì)胞數(shù)為（365±21）、shRNA-1組（128±8）；PLC/PRF/5組的細(xì)胞數(shù)為（267±44）、shRNA-1組（79±12）。與對照組相比較，shRNA-1組可明顯抑制HCCLM3和PLC/PRF/5的細(xì)胞侵襲能力（P＜0.01）。見圖7，8。

2.5慢病毒載體抑制B7-H4表達(dá)對HCCLM3和PLC/PRF/5細(xì)胞遷移能力的影響HCCLM3對照組的細(xì)胞遷移率為（82%±13%）、shRNA-1組（44%±6%）；PLC/PRF/5對照組細(xì)胞遷移率為（77%±9%）、shRNA-1組（41%±6%）。與對照組相比較，shRNA-1組明顯抑制HCCLM3和PLC/PRF/5的細(xì)胞遷移能力（P＜0.05）。見圖9，10。

圖7 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組侵襲情況（×200）

圖8 肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制后的各組侵襲情況（×200）

圖9 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組遷移情況圖（×100）

圖10 肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制后的各組遷移情況（×100）

3 討論

B7-H4是B7家族近年來最新發(fā)現(xiàn)的新型共免疫分子，其主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。數(shù)年來，其研究重點(diǎn)在于共免疫分子機(jī)制上，很少關(guān)注到該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的詳細(xì)機(jī)制。該分子一般不在組織中表達(dá)，但其在多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。如結(jié)腸癌、ICC等［1-2，4］。我們在對結(jié)腸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)該分子可能參與結(jié)腸癌的肺轉(zhuǎn)移過程。同時(shí)在ICC的研究中，發(fā)現(xiàn)其可明顯促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，可參與腫瘤的EMT過程及抑制ICC細(xì)胞的凋亡。過表達(dá)B7-H4可增加ICC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡過程。該過程與Bcl-2/bax的表達(dá)失調(diào)可能有關(guān)［2-6］。Qian等［7］的研究也發(fā)現(xiàn)，B7-H4可增加細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，最終使得caspese-3表達(dá)發(fā)生改變并促進(jìn)凋亡。另有研究指出，B7-H4可調(diào)節(jié)激酶1/2erk等的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞凋亡過程［2，5-6］。此外，B7-H4的過表達(dá)可能與Fas/FasL信號通路相關(guān)，對細(xì)胞的凋亡同樣有一定作用［8-9］。Jeon等通過研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4可誘導(dǎo)NF-κB信號激活。而NF-κB通路的抑制可阻止癌細(xì)胞侵襲。同時(shí)NF-κB信號傳導(dǎo)也與細(xì)胞EMT有關(guān)。

B7-H4可參與腫瘤發(fā)生的多個(gè)過程，如研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)B7-H4可增強(qiáng)細(xì)胞增殖。Zhang等［9-11］研究認(rèn)為，B7-H4可能發(fā)生從細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核的穿梭。因其基因包含核定位序列，而核內(nèi)的B7-H4與Cyclin E/D1的表達(dá)有關(guān)，參與細(xì)胞周期G/S期的調(diào)控。還有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4可促使人結(jié)腸癌SW-620及RKO的增殖。同時(shí)，體內(nèi)過表達(dá)B7-H4可使裸鼠腫瘤生長加速。一些研究指出B7-H4可能與JAK2/STAT3及缺氧誘導(dǎo)因子HIF信號通路有關(guān)。

B7-H4的過表達(dá)還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)B7-H4可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力增加。我們最終發(fā)現(xiàn)該過程可能與細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化及PI3K/AKT通路激活有關(guān)［1，4，10-12］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4與CXCL-12趨化因子及其受體的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)有關(guān)，B7-H4表達(dá)被下調(diào)后，細(xì)胞侵襲能力也隨之下調(diào)［10-13］。Kang等［14］的研究認(rèn)為，B7-H4 的抑制可通過提高CD107a顆粒酶A顆粒酶B穿孔素和IFN-γ的表達(dá)和分泌水平來幫助CD8+T恢復(fù)抗腫瘤免疫。同時(shí)他們在HCC的荷瘤小鼠模型中，B7-H4的過表達(dá)可以增加實(shí)驗(yàn)組的小鼠平均腫瘤體積。同時(shí)另有研究發(fā)現(xiàn)，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測來自93例HCC病人和55名健康志愿者的血液樣本中的循環(huán)sB7-H4水平，并統(tǒng)計(jì)分析sB7-H4水平與臨床病理因素、總生存期（OS）和復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果表明血清中sB7-H4的表達(dá)水平可作為診斷或預(yù)測HCC病人臨床結(jié)果的獨(dú)立預(yù)測因子［14-15］。我們最新研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4下調(diào)的裸鼠其肝內(nèi)肝癌癌細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移的傾向也會受抑制。而血清中的B7-H4與病人的臨床各指標(biāo)密切相關(guān)，血清中B7-H4越高，其預(yù)后越差，越易復(fù)發(fā)。同時(shí)在后續(xù)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)基于HCCLM3的肝癌細(xì)胞研究層面上，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程更容易在裸鼠上進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相比其他細(xì)胞系來說，可以更好的研究B7-H4的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移的抑制。

本研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且肝癌中B7-H4表達(dá)越高，病人越容易復(fù)發(fā)。同時(shí)，抑制B7-H4后，HCCLM3肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力均明顯減弱，而腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力對腫瘤的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。結(jié)果表明，shRNA-1組抑制效果較為理想，shRNA-2組抑制效果較差，可能存在脫靶效應(yīng)。本研究揭示可通過抑制B7-H4表達(dá)減弱HCCLM3肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力，這與我們以往多個(gè)研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，慢病毒載體抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞B7-H4表達(dá)可抑制該細(xì)胞侵襲及遷移活性，B7-H4有望成為HCC潛在的治療靶點(diǎn)及肝癌治療藥物研發(fā)新方向。

（本文圖1見插圖9-3）