張 灝，楊 超

（1. 中國人民大學附屬中學，北京 100080；2. 中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，北京 100193）

蘑菇圈(fairy ring)是由土壤中擔子菌類真菌引起的一種常見的草地生態(tài)學景觀[1]。真菌菌絲體的蔓延并輻射狀生長構成了蘑菇圈，且菌絲體的生長代謝活動對相應的植物和土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，使植物也呈現(xiàn)圈狀分布[2]。目前對蘑菇圈的研究主要集中在蘑菇圈對植物生物量和土壤理化性質(zhì)的影響。許多研究者對蘑菇圈的關注均來自于對草原上圈帶狀濃綠植物的觀察。由于蘑菇出菇時間短，且蘑菇子實體容易受到環(huán)境氣候條件的影響，因此蘑菇圈產(chǎn)生菌的子實體一般不容易被觀察到。相反，在雨后草原上經(jīng)?？吹饺~色濃綠的綠草環(huán)[3-6]。綠草環(huán)的形成一方面是由于土壤中有機質(zhì)被蘑菇圈產(chǎn)生菌的菌絲快速分解，進而釋放了植被可利用的速效養(yǎng)分，間接提高了植被的營養(yǎng)狀況，同時也與真菌的特殊攝食方式有關。死亡的菌絲體被降解后大量速效養(yǎng)分的釋放使得圈內(nèi)綠草環(huán)上的植物比圈外區(qū)域的植物繁茂和濃綠[2]。通常綠草環(huán)上植物生物量及蛋白質(zhì)含量顯著增加[7-10]。綠草環(huán)上植物中的蛋白質(zhì)、纖維素、鈣、磷含量分別提高3.7、2、1.6和3.9倍[11]。許多研究表明，在蘑菇圈的綠草環(huán)區(qū)域中土壤全氮、速效氮、速效磷、速效鉀含量均高于圈外區(qū)域[6,12-14]。且圈上土壤中的細菌、放線菌、真菌數(shù)量高于圈內(nèi)和圈外[15-20]。在對于蘑菇圈土壤細菌結構方面的進一步研究表明，蘑菇圈真菌存在增加了土壤細菌多樣性，改變了土壤細菌多樣性結構[21]。然而蘑菇圈真菌對于土壤真菌結構的影響及蘑菇圈土壤理化性質(zhì)與土壤真菌結構之間的關系的研究還鮮有報道。因此，本研究通過分析蘑菇圈3個區(qū)域(圈外、圈上和圈內(nèi))的植被氮磷營養(yǎng)、土壤理化性質(zhì)及土壤真菌結構，旨在補充對蘑菇圈土壤真菌結構方面的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究地點位于河北省沽源縣北部、內(nèi)蒙古錫林郭勒草原南緣 (41°46′ N，115°41′ E，海拔 1 380 m)，屬于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)與草地生態(tài)系統(tǒng)空間交錯分布的典型地段。該地區(qū)是以羊草(Leymus chinensis)為優(yōu)勢種的天然草地。屬半干旱大陸性氣候，冬季寒冷干燥，夏季溫和濕潤。年均溫為-4.4 ℃，最冷的1月均溫為-23.04 ℃，最熱的7月均溫為17.94 ℃。年降水量430 mm左右，多集中在7-9月。水熱同期，對蘑菇生長十分有利。該地區(qū)土壤以栗鈣土為主。這些土類有機質(zhì)較豐富，質(zhì)地較輕，疏松，通氣良好，為蘑菇生長提供了良好的環(huán)境。植被以根莖禾草和叢生禾草為主，羊草為建群種[19]。

1.2 樣品采集

試驗以自由放牧利用草地為研究對象，2016年8月，選擇3個發(fā)育良好的蘑菇圈由外依次向內(nèi)采集植被及土壤樣品(圖1)。包括圈外(對照)、圈上和圈內(nèi)；植物樣品采集用25 cm × 25 cm的樣方框。在樣方內(nèi)采用直徑為3.8 cm的土鉆按照五點取樣法采集0-15 cm土層的土壤。土壤混勻，裝入自封袋，在保溫箱中冷藏處理后，帶回實驗室。用2 mm篩子篩出植物根、石子及其他碎屑物。土壤樣品分為兩份，一份用于測定土壤理化性質(zhì)，另一份保存于-20 ℃冰箱中，用于微生物結構測定。

圖1 樣品采集區(qū)示意圖Figure 1 Schematic diagram of sample collection area

1.3 樣品檢測

植物和土壤全氮含量的測定用全自動凱氏定氮法[22]；植物和土壤全磷含量測定用HClO4-HNO3消煮鉬銻抗比色法；土壤全碳用土壤總碳分析儀測定；土壤有效磷濃度的測定用NaHCO3溶液浸提-鉬銻抗比色法；有效氮濃度的測定用KCl溶液浸提后，用連續(xù)流動分析儀測定銨態(tài)氮(NH4+-N)+硝態(tài)氮(NO3--N)的濃度，兩者之和即為有效氮含量。利用pH電導率儀測定土壤的pH及電導率值。稱重法測土壤含水量。

使用Illumina Miseq PE300測序平臺對土壤微生物的ITS1和ITS2區(qū)段進行測序，獲得環(huán)境微生物群落組成和分類信息。上機測序前用帶有Tag標簽序列和adapter序列修飾的引物ITS1(5'-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2 (5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3')對樣品微生物DNA的ITS區(qū)進行擴增，再將擴增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物純化效果，測定純化后PCR產(chǎn)物的濃度，將純化產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，以備上機前純化和測序儀分析。以上試驗均由商業(yè)測序公司完成(奧維森，北京)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。在科水平上分析真菌群落相對豐度，用來比較蘑菇圈不同區(qū)域微生物群落組成差異。采用單因素方差分析(ANOVA)分析蘑菇圈不同區(qū)域植被、土壤理化指標和真菌多樣性指數(shù)在P＜ 0.05水平上的統(tǒng)計學差異性。用Pearson相關性分析土壤理化指標與真菌結構之間的關系。用于土壤微生物與土壤理化性質(zhì)相關性分析的土壤理化指標部分數(shù)據(jù)來源于文獻[21]，并使用Sigmaplot 12.5制圖。

2 結果

2.1 蘑菇圈真菌對植被的影響

單因素方差分析結果表明(圖2)，在蘑菇圈發(fā)生的圈上區(qū)域，植被生物量、含氮量及含磷量均顯著高于圈外及圈內(nèi)區(qū)域(P＜ 0.05)。圈內(nèi)區(qū)域的含氮量顯著低于圈外對照(P＜ 0.05)，而圈內(nèi)區(qū)域的植被磷含量顯著高于圈外對照(P＜ 0.05)?？梢姡⒐饺Φ拇嬖陲@著改變了植被的營養(yǎng)成分。

2.2 蘑菇圈真菌對土壤理化性質(zhì)的影響

單因素方差分析結果表明(圖3)，在蘑菇圈發(fā)生的圈上區(qū)域，土壤含水量和土壤有效氮含量顯著低于圈外對照(P＜ 0.05)。圈外對照的土壤pH顯著低于圈上和圈內(nèi)(P＜ 0.05)，相反，圈外對照的土壤電導率顯著高于圈上和圈內(nèi)區(qū)域(P＜ 0.05)。而土壤有效磷含量在圈上區(qū)域顯著高于圈外和圈內(nèi)(P＜ 0.05)?？梢?，蘑菇圈的存在顯著改變了土壤理化性質(zhì)。

2.3 蘑菇圈真菌對土壤真菌結構的影響

真菌群落α-多樣性指數(shù)分析表明(圖4)，蘑菇圈發(fā)生區(qū)域的土壤真菌多樣性指數(shù)(香農(nóng)維納指數(shù))顯著高于圈外對照(P＜ 0.05)，且在圈上和圈內(nèi)區(qū)域檢測出的真菌數(shù)量也顯著高于圈外對照(P＜ 0.05)。

圖2 蘑菇圈不同區(qū)域植被生物量及氮磷營養(yǎng)Figure 2 Plant biomass, nitrogen, and phosphorus concentrations in different zones of fairy rings

土壤真菌類群相對豐度可分別反映土壤真菌群落組成(圖5)?？扑椒诸惤Y果顯示，在蘑菇圈圈上區(qū)域傘菌科(Agaricaceae)、囊擔菌科(Cystobasidiaceae)、戴維迪科(Davidiellaceae)和叢赤殼科(Nectriaceae)的相對豐度均顯著高于圈外區(qū)域(P＜ 0.05)，其中傘菌科、囊擔菌科及叢赤殼科在圈內(nèi)區(qū)域的相對豐度同樣顯著高于圈外區(qū)域(P＜ 0.05)。相反，對于囊藻科(Cystofilobasidiaceae)、大壺菌科(Chytridiaceae)和蟲草科(Cordycipitaceae)圈外區(qū)域的相對豐度要顯著高于圈上及圈內(nèi)(P＜ 0.05)。

圖3 蘑菇圈不同區(qū)域土壤含水量、土壤酸堿度、電導率、土壤有效氮及有效磷含量Figure 3 Soil water content, pH, EC, and available nitrogen and phosphorus in different zones of fairy rings

圖4 蘑菇圈不同區(qū)域土壤真菌多樣性指數(shù)及觀察到的真菌數(shù)量Figure 4 Soil fungal Shannon-Wiener index and overserved fungi number in different zones of fairy rings

圖5 蘑菇圈不同區(qū)域土壤真菌在科水平上的相對豐度Figure 5 The relative abundance of soil fungi at family levels in different zones of fairy rings

2.4 土壤真菌結構與土壤理化性質(zhì)的相關性分析

總體上看，大部分微生物類群與土壤含水量、土壤pH、電導率、全碳含量和全氮含量等理化指標均呈現(xiàn)或正或負的相關性(表1)，說明土壤理化性質(zhì)的差異是影響土壤微生物組成的重要因素。傘菌科和戴維迪科菌與土壤含水量及有效氮含量均呈顯著(P＜ 0.05)或極顯著(P＜ 0.01)負相關關系，同時與土壤有效磷含量呈極顯著正相關關系。囊擔菌科真菌與土壤電導率呈顯著負相關關系，與土壤全碳含量呈極顯著負相關關系。被包霉科

(Mortierellaceae)、囊藻科及叢赤殼科真菌與全碳含量均呈顯著或極顯著正相關關系，同時被包霉科、囊藻科與土壤有效磷含量呈顯著或極顯著負相關關系。大壺菌科與土壤pH、全碳含量、全氮含量及全磷含量均呈顯著或極顯著負相關關系，同時與土壤電導率呈極顯著正相關關系。而蟲草科真菌與土壤全氮含量及全磷含量均呈極顯著正相關關系。

3 討論與結論

蘑菇圈綠草環(huán)上的植物生長較兩側更為濃綠旺盛[3]。通過調(diào)查分析圍欄保護的3個蘑菇圈上的植物生長狀況，植物地上生物量在圈上和圈外正常草區(qū)分別為928.2和247.8 g·m-2，蘑菇圈上植物生物量提高3倍左右，有明顯的增產(chǎn)現(xiàn)象[4,13]。圈上優(yōu)勢植物羊草的出現(xiàn)頻率增加，其株高和株數(shù)明顯增加，且圈上植被氮含量及磷含量均顯著高于圈外，其主要原因是蘑菇圈生草層土壤中速效養(yǎng)分含量較高[15]，之前有研究發(fā)現(xiàn)，圈上區(qū)域土壤有效磷含量顯著增加，給植被補充了磷元素[1]，本研究結果進一步表明，蘑菇圈圈上區(qū)域土壤含水量顯著降低，這可能是由于圈上區(qū)域生物量的增加會消耗較多的土壤水分，且植被的蒸騰作用也會帶走大量土壤水分。然而，本研究結果發(fā)現(xiàn)，在蘑菇圈圈上區(qū)域土壤有效氮含量卻低于圈外對照區(qū)域，這與前人的研究結果不一致。相對于其他營養(yǎng)元素，氮素是植物需求最多的營養(yǎng)元素，由于圈上區(qū)域植物的地上生物量提高了3倍左右，且圈上區(qū)域的植物含氮量也高于圈外。因此圈上區(qū)域植物會從土壤中帶走大量的有效氮，從而降低了土壤中的有效氮含量。

表1 土壤理化性質(zhì)與主要微生物類群的相關分析Table 1 Correlation analysis between soil physical and chemical properties and major microbial communities

蘑菇圈真菌之所以能提高植被生物量，主要是其改變了土壤理化性質(zhì)。土壤是土壤微生物賴以生存的環(huán)境，土壤微生物必定會受到蘑菇圈真菌的影響[21]。前人的許多研究結果都表明，圈上土壤中的細菌、放線菌、真菌數(shù)量高于圈內(nèi)和圈外，且細菌 ＞ 放線菌 ＞ 真菌，纖維素分解菌數(shù)量也高于圈外[15-20]。浸麻芽孢桿菌(Bacillusmaccrans)和德氏食酸菌(Acidovoraxdelafieldii)在蒙古口蘑圈上數(shù)量增加顯著，被認為是蒙古口蘑的有益微生物[15-16]。蘑菇圈產(chǎn)生菌菌絲能刺激細菌類群的生長和繁殖。最新的研究進一步表明，只有在蘑菇圈真菌發(fā)生過的區(qū)域，即圈上及圈內(nèi)區(qū)域檢測出微桿菌科(Microbacteriaceae)的細菌[19]。本研究在分析土壤真菌結構時發(fā)現(xiàn)，在蘑菇圈圈上區(qū)域傘菌科、囊擔菌科、戴維迪科和叢赤殼科的相對豐度均顯著高于圈外區(qū)域，其中傘菌科、囊擔菌科及叢赤殼科在圈內(nèi)區(qū)域的相對豐度同樣顯著高于圈外區(qū)域。相關分析表明了影響其分布的土壤因子。土壤有機質(zhì)含量及土壤有效磷含量是影響土壤真菌結構的主要土壤因子。

綜上所述，蘑菇圈真菌的存在改變了土壤的理化性質(zhì)，活化土壤養(yǎng)分，增加植被生物量及營養(yǎng)狀況，且土壤理化性質(zhì)的改變對土壤真菌結構的影響顯著。植被-土壤-微生物是草地生態(tài)系統(tǒng)的主體，其中任意一個因素的改變會影響其他兩個因素。