陳 玥, 王佩娟, 陳 思, 盧 燕

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科, 南京 210028)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指40歲之前由于卵巢內(nèi)卵泡耗竭或破壞而發(fā)生卵巢功能衰竭的一種綜合征。POF 的發(fā)病率： 20 歲以前約為0.01%, 30 歲前約0.1%, 40 歲前約1%[1]，超過(guò)半數(shù)的本病患者具有不良情緒甚至抑郁、厭世[2]，嚴(yán)重影響女性身心健康，造成社會(huì)負(fù)擔(dān)。發(fā)病率的逐年升高及病患年輕化的現(xiàn)狀，與生育年齡的整體延后和社會(huì)對(duì)精神心理健康關(guān)注形成強(qiáng)烈矛盾。本病的致病因素包括：遺傳因素、感染因素、自身免疫因素、醫(yī)源性損傷及精神因素等[3]，約1/3 的POF 的發(fā)病與自身免疫異常密切相關(guān)。然而迄今為止，有關(guān)POF 的免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展十分緩慢，究其原因之一是缺乏用于開(kāi)展各項(xiàng)藥物實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型。本研究根據(jù)近幾年國(guó)內(nèi)外POF相關(guān)動(dòng)物模型研究進(jìn)展，選取(C57BL/6 × A/J) F1(B6AF1)雌鼠作為研究對(duì)象，將透明帶3 多肽(pZP3) 抗原分別與不同佐劑混合免疫小鼠, 觀察其免疫效果, 以期建立免疫性POF動(dòng)物模型，進(jìn)一步探究POF 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 A/J 小鼠10 只，雌性C57BL/6小鼠30 只，均為7～9 周齡，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)2007-004]，于江蘇省中醫(yī)藥研究院屏障設(shè)施飼養(yǎng)并繁殖B6AF1 小鼠[(C57BL/6×A/J) F1]。本實(shí)驗(yàn)取6～8 周齡B6AF1 雌鼠80 只分為：空白組、不完全弗氏佐劑(IFA)組、完全弗氏佐劑(CFA)[含結(jié)核分枝桿菌(TB)1 mg/mL] 組和IFA+ TB(3.3 mg/mL)組，每組20 只。體質(zhì)量21～23 g，自由攝食飲水，每日保持12 h 明暗交替，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～50%[SYXK(蘇)2016-0018]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

透明帶3(ZP3)330～342 氨基酸系列的多肽片斷[pZP3，ZP3330-342(NSSSSQFQIHGPR)]，分析純度＞95%，購(gòu)自上海吉爾生化有限公司。IFA(#344291)、CFA(#344289)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, #231141) 購(gòu)自美國(guó)BD Difco 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理與分組

采用雙蒸水將pZP3 配制成為1 mmol/mL的溶液。與1.1 對(duì)應(yīng)的3 組分別選取 IFA、含1 mg/mL的TB H37Ra 的CFA、 經(jīng)配制含有3.3 mg/mL 的TB H37Ra 的CFA與pZP3 溶液按等比例混合配成免疫乳化劑，用0.1 mL 乳化劑注射腳掌和尾根皮下免疫小鼠，第14 日加強(qiáng)免疫1 次。空白組選擇生理鹽水。

1.4 取材與卵巢HE 染色

自第1 次免疫后28 d 處死小鼠，取小鼠卵巢組織HE 染色： 將卵巢放入Bouin 氏固定液，24 h后脫水包埋，常規(guī)石蠟切片5 μm，進(jìn)行HE 染色。病理切片在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

免疫各組B6AF1小鼠均出現(xiàn)了體質(zhì)量明顯下降，精神萎靡不振、反應(yīng)遲鈍和行動(dòng)遲緩。

2.2 小鼠動(dòng)情周期的改變

免疫后各組小鼠出現(xiàn)不同程度的動(dòng)情周期紊亂, 表現(xiàn)為動(dòng)情周期縮短、延長(zhǎng)和持續(xù)動(dòng)情周期，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

2.3 卵巢組織病理學(xué)觀察

空白組卵泡數(shù)量較多，發(fā)育較好，有成熟卵泡，各級(jí)卵泡均有，卵泡形態(tài)規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列整齊(圖1A)； IFA 組見(jiàn)少量卵泡，卵泡形態(tài)尚規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列較紊亂，有一個(gè)次級(jí)卵泡(圖1B)； CFA 組見(jiàn)大量初級(jí)卵泡，卵泡形態(tài)尚規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列紊亂(圖1C)； IFA+TB 組見(jiàn)少量卵泡，未見(jiàn)次級(jí)卵泡及成熟卵泡，卵泡形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。說(shuō)明不同濃度佐劑免疫后均導(dǎo)致小鼠POF 模型，高濃度組免疫效果最好。

3 討論

Rhim 等[4]在1992 年報(bào)道pZP3 可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗ZP3 抗體, 與卵巢ZP3 結(jié)合引起免疫反應(yīng), 從而引起類似于人類POF 的表現(xiàn)如儲(chǔ)備卵泡減少、卵巢體積萎縮等。不同種系小鼠在免疫反應(yīng)性方面存在顯著差異, 相同劑量pZP3 可引起B(yǎng)6AF1、BALB/c 小鼠自身免疫性卵巢炎，之后陸續(xù)有學(xué)者[5-7]選用BALB/c 小鼠造模成功。本研究選用成模率較高的B6AF1 雌鼠作為研究對(duì)象[8], 用弗氏佐劑聯(lián)合pZP3 多肽造模，具有操作簡(jiǎn)單、成模率高和死亡率低等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果提示, 與空白組比較,模型組小鼠的動(dòng)情周期紊亂，卵巢萎縮，卵巢組織病理表現(xiàn)提示為自身免疫性卵巢炎, 且卵巢組織內(nèi)淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn), 符合免疫性POF 的特點(diǎn)[9]。

佐劑本身不具備免疫原性, 與抗原物質(zhì)一起注射或預(yù)先注入機(jī)體后，起到免疫增強(qiáng)的作用，使機(jī)體更早、更有效、更持久地產(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]，佐劑與抗原合用時(shí)能顯著增強(qiáng)抗原免疫效應(yīng)[11]。其可能的作用機(jī)制有二：一是與局部淋巴細(xì)胞接觸可濃縮抗原, 即儲(chǔ)存效應(yīng)(depot effect)； 二是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能。

表 1 不同組別小鼠動(dòng)情周期的改變Table 1 Change of estrous cycle in the four groups

A： 空白組； B： IFA 組； C： CFA 組； D： IFA+TB 組圖 1 小鼠模型卵巢病理圖(HE ×100)

佐劑與抗原混合后形成“油包水”乳膠混合體, 這種抗原佐劑混合物的優(yōu)點(diǎn)在于： 一方面，抗原被乳劑包裹后可在注射部位緩慢釋放，能夠非常有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體；另一方面，油滴中免疫原的持續(xù)釋放加強(qiáng)佐劑活性，刺激局部免疫反應(yīng)。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的有弗氏佐劑、卡介苗、脂質(zhì)體和類病毒顆粒等。弗氏佐劑分為CFA 和 IFA 兩種，區(qū)別是前者含有TB 成分。CFA 所含的TB 的細(xì)胞壁成分可以加強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的抗體反應(yīng)。雖然有報(bào)道[12]其可引起注射局部皮膚潰瘍等反應(yīng)。且有致敏以及潛在的致癌作用等毒副作用，但其高度佐劑活性是其它物質(zhì)難以媲美的。

綜上所述，弗氏佐劑聯(lián)合pZP3 誘導(dǎo)B6AF1小鼠可以成功構(gòu)建免疫性POF模型，同時(shí)引起卵巢組織局部淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)導(dǎo)致免疫性卵巢炎，含高濃度TB 的試劑造模效果更好。