馬 軍, 羅居?xùn)|, 景文江, 張淑蓮, 王娟毅, 范志剛

(1. 漢中三二〇一醫(yī)院腫瘤科, 漢中 723000；

2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤中心, 常州 213164)

作為腫瘤治療的主要手段，放射治療廣泛應(yīng)用于多種腫瘤[1]。肺癌是死亡率增長最快的惡性腫瘤，它的發(fā)病率也一直在全世界占據(jù)首位[2～4]，肺腺癌屬于非小細胞肺癌，約占所有肺癌的80%,約75%的患者在確診時已處于中晚期，5 年生存率很低[5～8]。惡性腫瘤對射線的敏感性不高，即使接受高劑量射線，仍不能得到理想效果[9]。因此如何提高其放射敏感性成為重要研究課題。

目前，基因沉默結(jié)合放射治療已成為腫瘤治療的新趨勢[10]。在鼻咽癌、結(jié)腸癌、皮膚鱗狀細胞癌等腫瘤中, 關(guān)于通過干擾沉默血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因來治療的研究已經(jīng)有報道[11-13]。干擾VEGF 基因的方式在多種腫瘤中呈現(xiàn)明顯的抑制作用[14-17]。然而，關(guān)于siVEGF 對肺癌細胞放射敏感性的影響尚未報道。本研究通過建立A549荷瘤鼠模型, 利用體內(nèi)沉默VEGF基因的技術(shù)手段, 驗證siVEGF對放射治療非小細胞性肺癌敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器設(shè)備

5周齡雌性BALB/C-nu裸小鼠, 體質(zhì)量17～18 g,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0034]。A549細胞系購自ATCC, PCMV-VEGF siRNA 沉默質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計構(gòu)建，RNAi-MateTM轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪制藥技術(shù)公司, VEGF、β-actin 抗體購自Santa Crus 公司,q-PCR儀器采用美國ABI公司 7900HT型PCR儀。

1.2 方法

1 .2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素(100 IU/mL)的RPMl 1640 培養(yǎng)基。7 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長融合度為七八成時候進行細胞傳代。細胞實驗選用正處于對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 小鼠腫瘤模型的建立 胰酶消化對數(shù)生長的A549 細胞, 完全培養(yǎng)基終止消化。收集細胞并用無菌預(yù)冷的PBS 清洗2 次。細胞計數(shù)并且用PBS 重懸, 調(diào)整細胞的濃度為1×107/mL。200 μL均勻的細胞懸液注射于裸小鼠左后背部皮下。40 只裸小鼠共分為4 組，空白質(zhì)粒對照組、放療組、VEGF 基因沉默組、VEGF 基因沉默+放療組，每組10 只。以皮下結(jié)節(jié)長徑超過0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。接種當(dāng)日為1 d，接種7 d 后達到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，即為荷瘤小鼠，用于實驗。

1.2.3 目標(biāo)基因序列的選擇及siRNA序列設(shè)計 目標(biāo)基因靶序列是按照siRNA 設(shè)計原則，在基因編碼區(qū)進行選擇。然后設(shè)計特異性干擾序列，寧合成VEGF siRNA 正、反義寡核普酸鏈。無意義序列的干擾序列作為實驗對照(siMock)(表1)。

表 1 siVEGF 基因序列Table 1 The gene sequence of siVEGF

1.2.4 體內(nèi)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將荷瘤鼠隨機分為4組： 空白對照組(siMock)； 單純siVEGF 組； 單純放療組；siVEGF 加放療組。將10 μg siVEGF 及siMock 質(zhì)粒分別與30 μg RNAi-MateTM轉(zhuǎn)染試劑于150 μL無血清的1640培養(yǎng)基混勻待用。采用瘤內(nèi)局部多點注射法, 每次150 μL/只，7 d 重復(fù)注射一次, 共3 次。對照組和單純放療組注射siMock/RNAi-MateTM混合物； 單純siVEGF組和siVEGF加放療組注射siVEGF/RNAi-MateTM混合物，各放療組分別在最后一次給藥后2 d 進行照射。

1.2.5 放療條件 首先將裸小鼠固定, 使用鉛板對裸小鼠的除腫瘤外的其他部位進行防護。用美國VARIAN 2300C/D型雙光子直線加速器(300 cGy/min,4 Gy)局部照射腫瘤。

1.2.6 動物模型測量及HE 染色 按照動物飼養(yǎng)規(guī)定和動物倫理按規(guī)飼養(yǎng)裸小鼠。每日測量裸小鼠腫瘤大小(長徑和短徑)并計算腫瘤體積，檢測腫瘤的生長。腫瘤體積計算公式為V=0.5 a×b2(a 是長徑，b 是短徑)。放射治療當(dāng)日為實驗1 d，經(jīng)放射治療后，即實驗24 d 給裸小鼠施行安死術(shù)，收集各組裸小鼠完整腫瘤組織用于后續(xù)實驗。其中，部分組織固定后，石蠟包埋，常規(guī)切片，伊紅、蘇木素進行H E 染色。

1.2.7 Q-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后VEGF 的mRNA 表達收集腫瘤組織，T r i z o l 對組織進行裂解提取RNA。1 μg 總RNA 用于逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板，采用Taq PCR MasterMIx 試劑進行PCR 擴增反應(yīng)。VEGF 的上游引物序列為： 5'-TGCCTAG-ATCTCTCCAGAGAT-3', 下游引物序列為： 5'-TCG-TGCATATGTGCTTCTAC-3', 擴增長度為322 bp。PCR 擴增反應(yīng)條件如下： 98 ℃變性10 s、56 ℃退火30 s 和72 ℃延伸35 s, 循環(huán)30 次；再72℃延伸10 min。實時定量 PCR 的結(jié)果采用2-△△Ct法進行計算, 用內(nèi)參基因β-actin對各基因表達水平均一化, 2-△△Ct法計算公式： △Ct = Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因，△△Ct = △Ct實驗組- △Ct對照組。每組實驗至少重復(fù)3 次。

1.2.8 Western blotting 檢測轉(zhuǎn)染后VEGF的蛋白表達 各組腫瘤組織剪碎并用組織裂解液裂解，Bradford 法測量蛋白質(zhì)濃度。取各樣本20 μg 的蛋白勻漿液進行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% BSA 封閉后，分別加入兔抗鼠多克隆一抗VEGF (1∶1 000)，4 ℃，12 h?；厥找豢共⑾茨?，HRP 標(biāo)記的二抗孵育1 h，用ECL 發(fā)光法檢測蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實驗至少重復(fù)3 次。1.2.9 免疫組織化學(xué)檢測轉(zhuǎn)染后VEGF 的蛋白表達 取各組腫瘤組織, 質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中固定, 蔗糖梯度脫水24 h, 常規(guī)石蠟切片, 脫蠟后, 在枸櫞酸鈉緩沖溶液中進行高壓抗原修復(fù), 3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后, 正常血清封閉，4℃孵育在含有VEGF(1∶200)抗體工作液12 h。之后使用生物素標(biāo)記的二抗和HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，孵育30 min 后。之后經(jīng)過清洗, 顯色,復(fù)染和封閉后進行觀察。原始實驗數(shù)據(jù)的判讀方式： 判讀的胞核、胞漿染色的染色強度(0/1+/2+/3+)和染色陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用t 檢驗，免疫組織化學(xué)評分數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，計量數(shù)據(jù)用x-± s 表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siVEGF合并放療對腫瘤生長的影響

裸小鼠荷瘤生長曲線結(jié)果顯示： 裸小鼠皮下移植A549 細胞后，隨著時間的延長，各組腫瘤體積都增加, 相對于對照組, siVEGF單獨組和放療單獨組的腫瘤生長均有被抑制趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。但是siVEGF與放療聯(lián)合治療組的腫瘤生長卻被明顯抑制, 至20～24 d差異更明顯(P＜0.01)(圖1A)，而各組體質(zhì)量相差不大(圖1B),裸小鼠大體及皮下瘤組織照片見圖1C。

2.2 RT-PCR和Western blotting 分別檢測VEGF的mRNA 和蛋白的表達

處死質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的荷瘤鼠，取腫瘤組織，組織勻漿后，分別做RT-PCR 和Western blotting。結(jié)果表明：siVEGF 組相對于siRNA-Mock 組，VEGF mRNA 水平和蛋白水平有明顯下降，P＜0.05，說明質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功(如圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測VEGF的表達

VEGF 的免疫組織化學(xué)檢測表明, 與siMock組相比, siVEGF轉(zhuǎn)染組以及合并放療組, VEGF表達明顯降低, 即棕色顆粒顯色程度明顯降低(P＜0.05)；而單獨放療組，VEGF 的下降并不明顯。這進一步表明s i V E G F 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，同時，可見siVEGF 合并放療組腫瘤壞死組織增加(圖3)。

A： Q-PCR 驗證VEGF 的mRNA 水平變化； B： Western blotting 驗證VEGF 的蛋白水平變化； 與對照組比較, #P＜0.01圖 2 siVEGF 體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功Figure 2 siVEGF was successfully transfected in vivo

A： 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組； B： 單純放療組； C： siVEGF轉(zhuǎn)染組； D： siVEGF轉(zhuǎn)染加放療組； Bar=20 μm圖 3 免疫組織化學(xué)檢測VEGF 的蛋白表達Figure 3 Immunohistociemical staining detect tie expression of VEGF protein

2.4 siVEGF 合并放療對腫瘤壞死面積的影響

通過鏡下測量各個腫瘤壞死區(qū)域長徑和短徑用以估算腫瘤壞死面積。對腫瘤壞死面積的分析表明，與對照組比較, 單純siVEGF 轉(zhuǎn)染組腫瘤壞死面積增加不明顯, 單純放射組腫瘤壞死面積明顯增加(P＜0.05), 說明放療有效果。而siVEGF 聯(lián)合放射組顯著增加了腫瘤壞死面積(P＜0.01)(圖4A)。HE 染色顯示，壞死樣組織細胞縮小，碎裂，細胞凋亡明顯(圖4B)。

3 討論

作為最常見的高發(fā)病率、高死亡率的一種癌癥，全球每年大約有150 萬人被診斷為肺癌[1]。癌癥的發(fā)病率高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌治療失敗的兩個主要原因。對晚期或轉(zhuǎn)移性肺癌患者進行局部放療和化療是通常的治療方法。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個逐漸演化的多因素協(xié)同作用的長期過程，其中腫瘤的血管生成對于肺癌的生長和轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用。因而，靶向腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤發(fā)展的思路顯得尤為重要。

VEGF 是一種活性很強的血管發(fā)生和血管生成生成生長因子，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。多種腫瘤中VEGF 的水平與患者5 年存活呈負相關(guān)的關(guān)系； 多種組織類型的腫瘤細胞分泌VEGF, 通過旁泌生長刺激來引發(fā)內(nèi)皮細胞增殖及血管形成, 促進腫瘤的增殖[18]。在腫瘤放療過程中, VEGF 對輻射后血管再生起著重要的作用[19]。另外，VEGF可以協(xié)同抗凋亡蛋白Bcl-2抑制內(nèi)皮細胞凋亡, 促進血管生成，進而產(chǎn)生放射治療的抵抗[20]。研究[21]表明腫瘤微環(huán)境中，缺氧能夠明顯誘導(dǎo)VEGF 的產(chǎn)生，而且，腫瘤在放療過程中進一步增強了微環(huán)境的乏氧程度，促進了VEGF的分泌，進而促進了血管生成和腫瘤細胞對放療射線的抵抗。正是因為VEGF 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及放射敏感性的重要作用，VEGF 的靶向與腫瘤放療聯(lián)合療法表現(xiàn)出誘人的治療前景。

A： 腫瘤壞死面積的定量分析, 與對照組比較, *P＜0.05, #P＜0.01；B： H&E 染色, 1～4 分別為對照組、siVEGF 轉(zhuǎn)染組、放療組和siVEGF 轉(zhuǎn)染加放療組圖 4 siVEGF 合并放療增加腫瘤壞死面積Figure 4 siVEGF transfected and radiotherapy increase the necrotic area of tumor

非小細胞性肺癌惡性程度高，一般發(fā)現(xiàn)較晚，放療是其重要治療手段之一。如何增加腫瘤細胞的放射敏感性一直是放療研究的熱點和重點。作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式，RNA 干擾通過與目的基因同源的小干擾RNA在靶細胞內(nèi)形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體, 選擇性降解目標(biāo)基因mRNA, 進而有效降低目的基因的表達[22]。siRNA 在基因沉默過程中具有特異性、精準(zhǔn)性和高效性優(yōu)點[23]。因此通過沉默VEGF 基因，降低腫瘤細胞VEGF基因的表達，增強腫瘤細胞的內(nèi)在放射敏感性是一種新的增敏方式。在肺癌中沉默VEGF，可以起到抗腫瘤血管生成的作用[24,25]，同時沉默VEGF 可以增強鼻咽癌CNE-2 細胞對放射的敏感性[26], 同時, 抑制VEGF 可以增強光動力學(xué)療法對頭頸部腫瘤的治療[27]。

本研究利用 RNA 干擾技術(shù)，沉默肺癌細胞中 VEGF 的表達, 并且成功地建立了A549裸小鼠荷瘤模型, 實驗表明，siVEGF 能抑制體內(nèi)腫瘤的生長, 而且沒有觀察到明顯的毒副作用。siVEGF聯(lián)合放療組腫瘤生長明顯抑制，且腫瘤組織有較多的壞死。Q-PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)檢測表明, siVEGF 及siVEGF 配合放療組，VEGF 的表達明顯減弱。實驗表明瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的siVEGF 對A549 細胞有放射增敏作用，為臨床開展針對VEGF 基因的靶向治療和放射治療的聯(lián)合治療非小細胞性肺癌提供了實驗依據(jù)。