苗佳寧, 劉 波, 丁晶晶, 王莉莉

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心, 沈陽(yáng)110004)

(遼寧省環(huán)境與代謝疾病動(dòng)物模型研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng)110004)

FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)屬于LIM 蛋白家族成員之一。人類FHL 的LIM 蛋白家族包括5 個(gè)成員，F(xiàn)HL1、FHL2、FHL3、FHL4 和FHL5[1-4]。人類Fhl1 基因位于Xq27.2, 含有5 個(gè)外顯子，cDNA 全長(zhǎng)2 441 個(gè)堿基，編碼280個(gè)氨基酸[5,6]。 FHL1在骨骼肌和心肌中高水平表達(dá)，在細(xì)胞骨架重排、纖維形成和肌小節(jié)的組裝中發(fā)揮一定作用[7-9]。近年研究[10-12]表明，F(xiàn)hl1是人類6 種X 連鎖肌病的致病基因，包括： X 連鎖遺傳性的肩腓型肌病、X 連鎖姿勢(shì)性肌肉萎縮型肌病、X 連鎖的還原體肌病、埃-德二氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、X 連鎖退縮性的埃-德類似綜合征和脊柱強(qiáng)直綜合征。除了上述的X 連鎖肌病外, 有研究[13]表明Fhl1基因的表達(dá)下調(diào)和先天性馬蹄內(nèi)翻足的肌肉異常表型的形成有關(guān)。此外, 在部分特發(fā)性炎性肌病的患者體內(nèi)出現(xiàn)FHL1抗體, 引起骨骼肌自身免疫性損傷, 導(dǎo)致患者肌肉萎縮, 發(fā)音、吞咽困難[14]。因此, FHL1 對(duì)骨骼肌發(fā)育起到重要作用，F(xiàn)hl1 基因的突變和表達(dá)異?？梢砸鸶鞣N肌肉表型異常。探討Fhl1基因敲除(FHl1-ko)小鼠骨骼肌表型的分子機(jī)制將為揭示人類FHL1肌病的發(fā)生機(jī)制奠定一定基礎(chǔ)。因此，課題組前期應(yīng)用TALEN 技術(shù)制作了Fhl1-ko 小鼠, 并且發(fā)現(xiàn)2.5 月齡的Fhl1-ko小鼠脛骨前肌中肌原纖維和肌原纖維間的排列紊亂和Foxo1 介導(dǎo)的自噬水平和mTOR激活的蛋白合成有關(guān)[15]。Fhl1-ko 對(duì)不同年齡小鼠腓腸肌肌纖維分化和自噬水平的影響, 目前尚未見報(bào)道。因此, 本研究探討了Fhl1-ko 對(duì)2.5 月齡(青年)和8月齡(成年)小鼠腓腸肌中自噬水平和肌纖維類型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TALEN 技術(shù)制作的Fhl1-ko C57B6 小鼠，具體制作過程和基因型鑒定方法見文獻(xiàn)[15]。野生型(wt)C57B6雄性小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。wt 型和Fhl1-ko 型雄性C57B6小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室[SYXK(遼)2017-0004]。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

S1000Thermal cycler PCR 儀(美國(guó)Bio-rad 公司)，LightCycler 480 II 熒光定量PCR 儀(瑞士Roche 公司)，SynergyH1 全功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)BioTek 公司)，Amersham Imager 600 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(日本GE 公司)。

TRIZOL(美國(guó)Invitrogen 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 染料(日本Takara 公司)，總蛋白提取試劑盒(美國(guó)Invent 公司)，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo 公司)，GAPDH抗體 (中國(guó)上?？党晒?， LC3B抗體(美國(guó)CST 公司)，Beclin1 抗體(英國(guó)Abcam 公司)，P62 抗體、FHL1 抗體(瑞士Sigma 公司)。

1.3 Western blotting

2.5 月齡和8 月齡的wt 型和Fhl1-ko型雄性小鼠各5 只, 小鼠麻醉后切取腓腸肌。應(yīng)用Invent 總蛋白提取試劑盒提取30 mg肌組織的總蛋白, 具體操作步驟參照試劑盒說明書。應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)提取蛋白質(zhì)濃度, 應(yīng)用12.5%的SDSPAGE 進(jìn)行蛋白質(zhì)的凝膠電泳。Western bloting 所用的一抗稀釋比例如下GAPDH (1∶10 000), LC3B(1∶1 000), Beclin1(1∶500)，P62(1∶500)，F(xiàn)HL1(1∶2 000)。

1.4 定量PCR

用T R IZ O L 試劑提取各組小鼠腓腸肌總RNA。用反轉(zhuǎn)錄酶和 Oligo(dT)20 引物合成cDNA。定量 PCR 的引物序列見表 1。在定量PCR 過程中，每個(gè)基因重復(fù)擴(kuò)增 3 次， 基因的相對(duì)表達(dá)水平應(yīng)用 2－△△Ct方法計(jì)算。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖膠電泳分離并拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同基因型的小鼠鑒定結(jié)果

鼠尾基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，直接測(cè)序。不同基因型的小鼠基因組DNA 測(cè)序結(jié)果見圖1。

2.2 不同月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌自噬水平變化

與2.5 月齡wt 的小鼠腓腸肌相比，2.5 月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌肌中LC3B 和Beclin 1 明顯增加，P62 卻并沒有明顯降低。而與8 月齡wt 小鼠的腓腸肌相比, 8 月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌中LC3B明顯增加, 但是增加的幅度沒有2.5月齡小鼠中明顯。同時(shí), 8月齡Fhl1-ko小鼠腓腸肌中Beclin1表達(dá)水平改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, P62 的表達(dá)水平明顯增加(圖2)。

表 1 定量PCR 引物序列

wt 為野生型小鼠, ko 為Fhl1-ko 型小鼠； 下圖同圖 1 不同基因型的小鼠鼠尾基因組DNA 測(cè)序鑒定結(jié)果

2.3 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌肌纖維相對(duì)表達(dá)量

2.5月齡小鼠中, Fhl1-ko可以明顯降低腓腸肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量，明顯增加MYH IIB 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量, 而Fhl1-ko對(duì)青年鼠腓腸肌中MYHI 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量并沒有影響。在8 月齡小鼠中，F(xiàn)hl1-ko 可以明顯增加腓腸肌中MYHI和MYH IIA型肌纖維相對(duì)表達(dá)量，而對(duì)MYH IIX 和MYH IIB 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量沒有影響(圖3)。

3 討論

圖 2 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌自噬水平變化

細(xì)胞自噬是真核生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行代謝和更新的重要過程，在小鼠發(fā)育的不同階段, 自噬水平和骨骼肌中肌纖維類型是動(dòng)態(tài)變化的。在前期研究[15]中，我們發(fā)現(xiàn)2.5 月齡的Fhl1-ko 小鼠的脛骨前肌、肱三頭肌、腓腸肌(糖酵解型的II纖維組成)中自噬水平明顯增加，同時(shí)Fhl1-ko 可以明顯增加脛骨前肌中MYHI 型肌纖維含量，減少M(fèi)YHXII型和MYHIIB型肌纖維的含量。但是，F(xiàn)hl1-ko對(duì)不同年齡小鼠自噬水平和肌纖維分化的影響, 目前尚不清楚。因此, 本研究探討了2.5 月齡(青年小鼠)和8月齡(成年小鼠)Fhl1-ko小鼠腓腸肌中自噬水平和肌纖維相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果表明, Fhl1-ko 可以明顯激活青年小鼠(2.5 月齡)腓腸肌中Beclin1 介導(dǎo)的自噬水平，自噬流有受阻的表現(xiàn)(自噬激活時(shí)，P62 的降低是自噬流通暢的標(biāo)記。2.5 月齡的Fhl1-ko 小鼠腓腸肌中自噬明顯激活，但P62 并沒有降低)。而Fhl1-ko 后對(duì)成年小鼠(8 月齡)的自噬激活沒有青年鼠明顯。不同年齡, 不同物種的骨骼肌中自噬水平變化的研究結(jié)果并不一致。有研究[16]表明, 與7～8 月齡的成年大鼠相比，老齡大鼠(24～26 月齡)的比目魚肌和腓腸肌中雖然自噬的上游通路激活，但其基礎(chǔ)自噬水平降低。然而，在犬類的研究中卻發(fā)現(xiàn)老齡犬的骨骼肌中有 LC3 II 和Beclin 1的激活, 提示自噬水平的增加是衰老性肌萎縮的原因之一[17]。在研究衰老對(duì)Fischer 344 大鼠跖肌肌肉組織中自噬和凋亡的影響時(shí)發(fā)現(xiàn), 自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin-1在 衰老的跖肌肌肉組織中表達(dá)上調(diào)[18]。本文結(jié)果提示,Fhl1-ko 對(duì)青年小鼠(2.5 月齡)和成年小鼠(8 月齡)腓腸肌中自噬與自噬流的影響不同。有研究[19]表明，骨骼肌組織中特異肌纖維的含量受年齡影響。與老齡鼠相比，3 月齡的青年大鼠的比目魚肌中MYHIIA 型肌纖維含量較高，MYHI 型肌纖維含量較少。小鼠的腓腸肌的肌肉質(zhì)量在7 月齡時(shí)達(dá)到峰值, MYH IIA 型肌纖維含量、肌纖維大小和肌肉的收縮能力在8 月齡時(shí)達(dá)到峰值[20]。

圖 3 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌肌纖維相對(duì)表達(dá)量

在青年鼠中，F(xiàn)hl1-ko 可以明顯降低腓腸肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量, 同時(shí)明顯增加MYH IIB 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量, 而Fhl1-ko對(duì)2.5月齡腓腸肌中MYHI型肌纖維相對(duì)表達(dá)量并沒有影響。在成年鼠中，F(xiàn)hl1-ko 可以明顯增加腓腸肌中MYHI 和MYH IIA 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量，而對(duì)MYH IIX 和MYH IIB 型肌纖維相對(duì)表達(dá)量沒有影響。本文結(jié)果表明，F(xiàn)hl1-ko 對(duì)青年小鼠(2.5月齡)和成年小鼠(8月齡)腓腸肌中肌纖維的含量影響不同，提示Fhl1-ko 對(duì)不同年齡小鼠骨骼肌收縮能力的影響是不同的。

自噬在維持骨骼肌功能中發(fā)揮重要作用，有研究[21]表明，通過調(diào)節(jié)自噬信號(hào)通路可以作為治療年齡相關(guān)的少肌癥的潛在治療手段。本文結(jié)果表明，F(xiàn)hl1-ko 對(duì)青年小鼠(2.5 月齡)和成年小鼠(8 月齡)腓腸肌中自噬的影響不同。提示調(diào)節(jié)自噬水平可能是FHL1 基因突變和蛋白缺失所致的骨骼肌肌病的潛在治療手段，并且針對(duì)不同年齡段的患者應(yīng)采用差異化的精準(zhǔn)治療手段。