關(guān)雅倫, 劉書華, 黃忠強, 李韻峰, 李雪嬌, 李 舸, 張 鈺

(廣東省實驗動物重點實驗室, 廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣州510663)

阿爾茲海默癥(AD)是一種以認(rèn)知障礙和記憶力減退為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前AD 已成為全球老齡化社會中威脅老年人健康甚至生命的第一大殺手，至今缺乏有效的治療方法。因此，一直以來AD 都是神經(jīng)病學(xué)研究的熱點，而基于AD 相關(guān)致病基因構(gòu)建的各種遺傳工程小鼠成為AD 疾病研究不可或缺的模式動物，目前國際上常用的AD 小鼠有Tg2576、APP23、APP/PS1、3×Tg-AD 和5×FAD。其中, Tg2576小鼠是1996年由Hasio等[1]構(gòu)建的能產(chǎn)生認(rèn)知障礙和A β斑塊的轉(zhuǎn)基因AD 小鼠模型，是最早應(yīng)用于AD 研究的模式動物之一。該小鼠遺傳背景為C57BL/6J 和 SJL小鼠的雜交系，通過將編碼人的APP695 氨基酸異構(gòu)體基因序列轉(zhuǎn)入小鼠基因組后，小鼠過表達(dá)產(chǎn)生人APP (Lys670-＞Asn670,Met671-＞Leu671)突變體(瑞典型突變位點), 最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)AD 樣的臨床和病理改變。由于Tg2576 小鼠遺傳背景為雜交系, 當(dāng)雜交系小鼠作為親代進行長期繁殖后由于基因的隨機分離，將導(dǎo)致子代個體之間遺傳背景出現(xiàn)差異[2], 但這種差異是否影響動物表型目前并不清楚, 這也成為近年來Tg2576小鼠較其它單一遺傳背景的AD轉(zhuǎn)基因小鼠較少被應(yīng)用于科學(xué)研究關(guān)鍵因素之一。本文作者針對本實驗室引進并長期繁使用的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠, 通過行為和病理表型分析，初步探討長期繁殖可能對該小鼠AD 表型產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

使用1 只12 周齡雄性Tg2576 小鼠(廣東藥科大學(xué)王麗京教授惠贈)和60只5周齡雌性C57BL/6小鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0002], 過體外受精、胚胎移植方式，獲得同期出生的6周齡SPF級Tg2576雌性小鼠和同窩對照C57BL/6 雌性小鼠各40 只(體質(zhì)量18～20 g)。動物實驗在廣東省實驗動物監(jiān)測所SPF 級設(shè)施內(nèi)進行[SYXK(粵)2016-0122]，所有小鼠分別飼養(yǎng)至6 月齡、9 月齡、12 月齡和15 月齡后, Tg2576小鼠和對照小鼠隨機各選取10 只進行實驗, 飼養(yǎng)期間動物自由采食飲水，12 h∶12 h 循環(huán)燈光,恒定濕度, 室溫(23±2) ℃。本次動物實驗獲得廣東省實驗動物監(jiān)測所(AAALAC認(rèn)證機構(gòu))動物實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(zhǔn)(IACUC編號2014027)。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

鼠抗Aβ 1-40 抗體，鼠抗Aβ 1-42 抗體(美國Biolegend公司), 兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(美國Millipore 公司)，硫磺素(美國Sigma-Aldrich 公司)，鼠鏈霉親和素-過氧化物酶免疫組織化學(xué)試劑盒(中國康為世紀(jì)生物科技有限公司)，抗兔Alexa Fluor 555免疫熒光二抗(美國Cell Signaling Technology公司),鼠Aβ 1-40 ELISA檢測試劑盒，鼠Aβ 1-42 ELISA檢測試劑盒(美國Invitrogen Life Technologies公司),多聚甲醛、 無水乙醇和二甲苯(中國上海化學(xué)試劑有限公司), Triton X-100(中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

Morris水迷宮(中國上海欣軟信息科技有限公司)，切片機、冷凍切片機、DM3000 正置顯微鏡和TCS SP5 激光共聚焦顯微鏡(德國Leica 公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 方法

1.3.1 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮由一個圓形水池(直徑120 cm，高度50 cm)和一個白色圓形平臺(10 cm)組成，水池周圍由1 m 高的布簾圍蔽，水池頂部放置攝像系統(tǒng)記錄動物運動軌跡。圓形水池被等分為4 個象限，每個象限的水池壁繪制幾何圖形便于動物進行定位，實驗前注水并將水溫保持在(24±1)℃，在第一象限中心固定放置白色圓形平臺，并調(diào)節(jié)高度至水面下1 cm處。小鼠在正式實驗開始前，先放置于平臺上觀察適應(yīng)環(huán)境，正式實驗開始后，連續(xù)進行5 d，前4 d，小鼠每日分別從4 個不同象限的固定位置入水，觀察記錄動物找到平臺的時間(潛伏期)，如果在60 s 內(nèi)找不到平臺，動物則被輕輕地引導(dǎo)到平臺上，每次試驗結(jié)束后小鼠留在平臺上休息10 s，再進行下一個象限的測試, 前4 d主要測試動物的學(xué)習(xí)能力。第5 日，將第一象限的平臺拆除，動物從對側(cè)象限入水，進行了一次60 s 的單一探測試驗，觀察記錄動物穿越平臺位置的次數(shù)，主要測試動物的記憶能力。動物運動軌跡自動化軟件進行跟蹤并分析。

1.3.2 腦組織樣品Aβ1-40 和42 免疫組織化學(xué)染色 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進行灌注, 取右半腦在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定過夜, 腦組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后, 包埋成石蠟組織塊。石蠟塊修塊后4 μm 切片, 在45 ℃水中展片后，貼于明膠玻片上放入烘箱中烘烤過夜用于后期染色。組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)后, 按照鼠鏈霉親和素-過氧化物酶免疫組化試劑盒操作說明，滴加山羊血清封閉, 加入1∶400 稀釋的一抗鼠抗Aβ 1-40 抗體或鼠抗Aβ 1-40 抗體孵育過夜后，經(jīng)PBS 充分漂洗后, 滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液室溫孵育30 min, 經(jīng)PBS 漂洗后，加入過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育30 min，經(jīng)PBS再次漂洗后，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色工作液，并在顯微鏡下觀察顯色。顯色完成后，將組織切片放入自來水中終止顯色，之后組織切片經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明，封片后在顯微鏡下進行鏡檢。

1.3.3 ELISA 檢測腦組織樣品Aβ 1-40 和Aβ 1-42表達(dá) 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進行灌注，取左半腦準(zhǔn)確稱量后置于預(yù)冷的PBS 中，冰上充分勻漿，離心后獲得上清, 按照鼠Aβ 1-40 和Aβ 1-42 ELISA 檢測試劑盒說明書要求，將上清中的抗原與預(yù)先包被Aβ 1-40抗體或Aβ 1-42抗體的酶標(biāo)板進行孵育, 之后加入HRP標(biāo)記的二抗與一抗進行結(jié)合, 形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物, 經(jīng)過徹底洗滌后加底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織中的Aβ 1-40 和42 表達(dá)濃度。

1.3.4 腦組織樣品星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進行灌注, 取右半腦在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定過夜, 之后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%蔗糖溶液中再次過夜。腦組織過夜后在-20 ℃冰凍切片機下10 μm 連續(xù)切片。在進行免疫熒光前, 冰凍切片經(jīng)過0.3%的Triton X-100 破膜, 并用10%血清在室溫下封閉1 h。之后加入一抗兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體并在4 ℃避光孵育過夜, PBS漂洗后選擇抗兔Alexa Fluor 555 免疫熒光二抗在37 ℃下避光孵育1 h, 之后組織切片經(jīng)過硫磺素染Aβ 沉淀后, 在激光共聚焦顯微鏡下根據(jù)發(fā)光基團選擇激發(fā)光進行觀察拍照, 所有照片應(yīng)選擇相同的曝光時間, 最后利用顯微鏡自帶軟件對進行合成分析。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以x-± s 表示。實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tg2576 小鼠AD 樣行為特征變化

與對照小鼠比較, 從12 月齡開始, Tg2576 小鼠在水迷宮實驗的學(xué)習(xí)測試階段，定位航行逃避潛伏期時間在1～4 d 明顯出現(xiàn)分離，15 月齡時逃避潛伏期時間分離更明顯(圖1)。在第5 日拆除第一象限平臺后，從9 月齡開始，Tg2576 小鼠

A： 6 月齡； B： 9 月齡； C：12 月齡； D： 15 月齡； 與對照小鼠比較： *P＜0.05； **P＜0.01圖 1 不同月齡Tg2576 小鼠逃避潛伏期實驗

在水迷宮實驗的記憶測試階段比對照組小鼠穿越平臺位置的次數(shù)開始減少, 15月齡穿越平臺次數(shù)明顯減少(圖2)。

2.2 Tg2576 小鼠腦組織Aβ 斑塊的變化

圖 2 不同月齡Tg2576 小鼠穿越平臺實驗

對小鼠腦組織進行Aβ 1-40和Aβ 1-42免疫組織化學(xué)染色顯示，與對照小鼠相比，12 月齡的Tg2576 小鼠腦組織中可見明顯的Aβ 斑塊的沉積，毒性蛋白沉積物主要集中在大腦皮層(圖3A)和海馬區(qū)(圖3C), 且大腦皮層的Aβ 斑塊沉積物相對較多，同時, 血管周圍也出現(xiàn)典型Aβ 斑塊的沉積(圖3B)。對小鼠腦組織進行Aβ 1-40 和Aβ 1-42蛋白定量分析表明，Tg2576 小鼠腦組織Aβ 1-40蛋白從12月齡開始出現(xiàn)顯著升高，蛋白水平表達(dá)是同齡對照小鼠20 倍以上(圖4A)。而Aβ 1-42 蛋白則從9 月齡開始出現(xiàn)顯著升高，蛋白水平是同齡對照小鼠17 倍以上(圖4B)。

A： 皮層, 比例尺100 μm； B： 皮層血管，比例尺100 μm； C： 海馬, 比例尺50 μm圖 3 12 月齡Tg2576 小鼠大腦皮層Aβ 斑塊免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

A： Aβ 1-40； B： Aβ 1-42； 與對照小鼠比較, *P＜0.05； **P＜0.01圖 4 不同月齡Tg2576 小鼠腦組織Aβ 1-40 和Aβ 1-42 蛋白檢測

2.3 Tg2576 小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

對小鼠腦組織進行星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色和硫磺素染色后發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比，從9月齡開始，Tg2576小鼠在大腦皮層區(qū)開始出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，隨著年齡增大，在大腦皮層區(qū)和海馬區(qū)均能夠觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，特別是在大腦皮層區(qū)出現(xiàn)大量星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集，通過與硫磺素共染發(fā)現(xiàn)，這些激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞主要聚集在Aβ 斑塊附近(圖5)。

3 討論

Tg2576 小鼠表型與AD臨床癥狀具有一定的相似性，表現(xiàn)在： 大量與淀粉樣斑塊產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白泛素化； 神經(jīng)元出現(xiàn)營養(yǎng)不良； α突觸核蛋白異常引起神經(jīng)元軸突退變； 膽堿能神經(jīng)元和腎上腺素能神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少，這些病理變化主要發(fā)生在淀粉樣斑塊和認(rèn)知缺陷之前，類似于AD 前驅(qū)期在人類中發(fā)生的認(rèn)知缺陷。同時，該小鼠還表現(xiàn)出慢性神經(jīng)炎癥，睡眠障礙等表型。但該小鼠同樣也表現(xiàn)出與人的AD 不一致臨床病理特征，例如，認(rèn)知缺陷衰退較臨床AD病人不顯著，無廣泛的神經(jīng)元丟失，無神經(jīng)纖維纏結(jié)形成，晚期糖基化終產(chǎn)物以及葡糖糖代謝顯著降低等。因此，該轉(zhuǎn)基因小鼠模型可能更適合臨床AD發(fā)生早期階段研究，還無法完全模擬AD發(fā)生發(fā)展過程中的臨床病理特征[3]。

GFAP 染色星形膠質(zhì)細(xì)胞(紅色熒光), 硫磺素染色Aβ 斑塊(綠色熒光)圖 5 不同月齡Tg2576 小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

對過去20年P(guān)UBMED數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，1998 年至今有994 篇研究論文使用了Tg2576小鼠, 但從2004 年開始，每年使用該小鼠發(fā)表的文章在50 篇左右。與常用的APP/PS1 小鼠相比，從2013年后, 使用Tg2576小鼠發(fā)表的研究論文數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢，這可能與該小鼠是在繁育使用中個體遺傳背景存在差異, 且遺傳背景影響著繁殖和行為變化有關(guān)。Lassalle等[4,5]將具有C57BL/6和SJL 雜交背景的Tg2576 小鼠與C57BL/6 回交后，連續(xù)3 代產(chǎn)仔數(shù)由6 只至4 只，最后下降至0； 而與CBA小鼠回交3代，每代產(chǎn)仔數(shù)平均在4.7只、5.3只和3.7只； 與C57BL/6和SJL(B6SJL)雜交1代小鼠繁殖6代, 每代產(chǎn)仔數(shù)平均在10.3 只、8.1只、5 只、5.9 只、7 只和7 只。由此可見，Tg2576小鼠維持B6SJL 混合背景具有較好的繁殖能力。

本研究選用長期在本實驗室繁殖保種的Tg2576雄鼠, 通過體外受精-胚胎移植方式獲得本實驗所需的小鼠, 并未出現(xiàn)在自然交配中無法繁育的情況。其次, 因遺傳背景所致雄性Tg2576 小鼠攻擊性較強, 很難群居飼養(yǎng)[6], 本研究中, 長期繁育后產(chǎn)生的Tg2576小鼠在飼養(yǎng)過程中仍然出現(xiàn)群居和諧性較差的情況，無論雌性或雄性都容易出現(xiàn)打斗現(xiàn)象, 該小鼠的這種特性對于需要長期進行的AD 相關(guān)研究造成較大困難。此外, 該小鼠攜帶Pde6brd1視網(wǎng)膜變性基因, 易造成個別動物對光敏感或失明，因此，需要在進行行為評價前排除。

Tg2576 小鼠AD樣行為學(xué)表型主要表現(xiàn)為年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙。Tg2576 小鼠最早在6 月齡開始出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷，以及環(huán)境恐懼現(xiàn)象，也有認(rèn)為, 該小鼠空間學(xué)習(xí)損傷出現(xiàn)在12個月以后[7]。本研究中，長期繁育的Tg2576 小鼠后代從9 月齡開始出現(xiàn)認(rèn)知行為損傷，仍然保持了該小鼠的AD 樣行為學(xué)特性。Hsiao 等[1]構(gòu)建的Tg2576 小鼠Aβ 斑塊的沉積主要出現(xiàn)在前額葉、顳葉、嗅皮質(zhì)區(qū)、海馬和小腦部位, 9～12 月齡鼠上出現(xiàn)了與年齡相關(guān)的淀粉樣斑塊, 11～13月齡小鼠的Aβ 1-42/43 的產(chǎn)生比2～8 月齡增加14 倍以上。本研究中, Tg2576 小鼠腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)典型的Aβ沉淀發(fā)生在9月齡以后與文獻(xiàn)報道較為一致。鑒于Tg2576 小鼠隨著月齡增大, 能產(chǎn)生典型的Aβ 斑塊, 以及大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生特點[8],目前該小鼠仍然是應(yīng)用于Aβ斑塊清除以及星形膠質(zhì)細(xì)胞參與AD 發(fā)生等研究中較好的模式動物，此外，Tg2576小鼠也被應(yīng)用于乙酰膽堿酯酶抑制劑[9]、美金剛胺和加蘭他明[10]以及疫苗的藥效評價中, 然而盡管使用Tg2576 小鼠進行AD 治療藥物臨床前評價顯示有效, 但在臨床應(yīng)用中實際應(yīng)用中仍然無法獲得陽性結(jié)果, 這也是目前使用的AD基因工程小鼠在藥效評價中面臨的主要問題。

綜上所述，我們對長期雜交繁育的Tg2576進行行為和病理結(jié)果檢測與文獻(xiàn)報道未出現(xiàn)明顯的差異，動物仍然能夠表現(xiàn)出典型的學(xué)習(xí)記憶功能衰退、Aβ 斑塊沉積以及星形膠質(zhì)細(xì)胞激活等表型，但由于長期繁育后該小鼠仍然攜帶SJL 小鼠背景，群養(yǎng)和諧性較差，導(dǎo)致長期飼養(yǎng)困難，群居性較差對于開展行為評價可能產(chǎn)生較大影響，這也成為近年來Tg2576 小鼠應(yīng)用較少的重要原因之一。