葛冰潔， 桑 銳， 于逸凡， 鄒 娟， 王 政， 張雪梅*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 長春市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130061)

藥物毒理學(xué)安全性評價是在了解藥物使用過程中對生理功能產(chǎn)生的不良影響的基礎(chǔ)上，從確保藥物的最大效益、對生態(tài)環(huán)境和人類健康最小危害性角度出發(fā)，全面權(quán)衡利弊和實際應(yīng)用的可能性，對藥物的合理生產(chǎn)和安全使用做出評價[1-3]，利用急性毒性和亞急性毒性試驗等確定藥物的一般毒性[4-5]，利用致突變和致畸試驗等確定藥物的遺傳毒性[6]。

現(xiàn)代藥理學(xué)表明，傳統(tǒng)中藥具有安全性高、副作用少、對胃腸道無損傷、對肝腎刺激小等優(yōu)點[7-10]，益生菌則具有調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、增強免疫力等功能[11-12]，但很多中藥由于自身結(jié)構(gòu)而不能被機體直接利用，需經(jīng)過腸道菌群處理后，才能發(fā)揮藥效[13]。研究證實中藥益生菌配伍制劑集成了中草藥和益生素的雙重優(yōu)點，具有毒副作用少、無殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢[14-18]。研制的中藥益生菌ZY由幾味中藥黃芪、蒲公英等的主要成分與益生菌枯草桿菌等科學(xué)組方而成，經(jīng)藥效學(xué)和臨床試驗證明對動物細菌性腹瀉具有良好的防治作用。此研究通過小鼠急性毒性、亞急性毒性、小鼠骨髓紅細胞微核和精子畸形試驗對中藥益生菌ZY進行毒理學(xué)安全性評價，為其臨床應(yīng)用與開發(fā)提供可靠的安全依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

清潔級昆明系小鼠160只，體重(20±2) g,雌性小鼠55只，雄性小鼠105只，購自延邊大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 藥品

中藥聯(lián)合益生菌ZY，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥理實驗室自行研制。提取中藥黃芪、蒲公英等主要成分，與益生菌枯草桿菌等按最佳配比組方而成；環(huán)磷酰胺(批號：H22022673)，購于廣東康愛多連鎖藥店有限公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(SW-CJ2FD)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；電子分析天平(AB145S)，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；雙開門冰箱(BCD-572WD),海爾集團公司；全自動滅菌鍋(LDZM-60KC)，上海申安醫(yī)療器械廠；自動組織脫水機(A130390)，艾測科技有限公司；生物組織包埋機(KD-BMIII)、自動切片機(KD-3368AM)，均購自金華科迪儀器有限公司；實體顯微鏡(CX31)，購自 OLYMPUS 公司；顯微鏡(SMART)，購自重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗[19-21]

將中藥益生菌ZY用蒸餾水配制成1 g/mL藥液，按照最大耐受量(MTD)法進行試驗，試驗前16 h試驗動物斷食不斷水。選擇雌雄各10只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照10 g/kg劑量24 h內(nèi)灌胃4次，2次給藥間隔6 h，累計給藥劑量為40 g/kg。記錄小鼠精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀，連續(xù)觀察14 d。

1.2.2 亞急性毒性試驗[22]

將40只小鼠隨機分為空白組和中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組，每組10只，雌雄各半，劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，每天同一時間給藥，連續(xù)14 d。觀察并記錄小鼠的體重及精神狀態(tài)、飲食情況、被毛光澤度等；14 d后剖檢，觀察主要臟器顏色、形狀、大小等組織病變情況，稱重并計算主要臟器指數(shù)，H.E染色法制作病理切片，用顯微鏡進行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗[23,24]

將50小鼠隨機分為空白組、中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組和陽性組，每組10只，雌雄各半。劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，陽性組按照40 mg/kg灌服環(huán)磷酰胺，采用30 h給藥法給藥，即連續(xù)2次給藥，間隔24 h，末次給藥6 h后脫頸處死，分別取兩側(cè)股骨制骨髓涂片、Giemsa染色。每張玻片計數(shù)2 000個嗜多染紅細胞(PCE)，并計數(shù)含微核的PCE, 計算微核率。

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率/‰= 含微核的PCE數(shù)/PCE總數(shù)×1000‰。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗[25-28]

將50只6～8周齡雄性小鼠隨機分為空白組、中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組和陽性組，每組10只，劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，陽性組按照40 mg/kg灌服環(huán)磷酰胺。連續(xù)給藥5天，于首次給藥后第35天采用脫頸法處死小鼠, 取兩側(cè)附睪制精子涂片、伊紅染色。每只小鼠計數(shù)5 000個完整精子, 并計數(shù)其中畸形精子數(shù)，計算精子畸形率。

小鼠精子畸形率/% = 畸形精子總數(shù)/檢查精子總數(shù)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大耐受量測定結(jié)果

在最大給藥體積和最大藥物濃度條件下，14 d內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡，且精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄等臨床癥狀均未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。最大耐受量試驗結(jié)果顯示，中藥益生菌ZY對小鼠的最大耐受量大于40 g/kg，根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，中藥益生菌ZY屬于無毒物質(zhì)。

2.2 亞急性毒性試驗測定結(jié)果

各組小鼠采食、飲水等行為均正常、精神狀態(tài)良好，未見中毒反應(yīng)；剖檢肝、腎、心等主要臟器未見外形異常、表面充血、瘀血、腫脹、滲出、粘連等變化。對小鼠體重的影響見表1，對臟器指數(shù)的影響見表2，組織病理學(xué)切片見圖1～3。

表1 中藥益生菌ZY對小鼠體重的影響

注：與空白組比較，“#”表示差異顯著(P<0.05)，“##”表示差異極顯著(P<0.01)，無肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05),下同。

由表1可知，與空白組相比，低劑量組小鼠體重差異不顯著(P>0.05)；中、高劑量組小鼠體重在給藥7 d后顯著增加(P<0.05)；高劑量組小鼠體重在給藥14 d后極顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY不會引起小鼠中毒反應(yīng)，并且能夠以劑量依賴性的方式促進小鼠體重的增加。

表2 中藥益生菌ZY對小鼠臟器指數(shù)的影響

剖檢受試小鼠，觀察肝、腎、心等主要臟器未見有異常變化。由表2可知，與空白組相比，各劑量組小鼠臟器指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY較長時間、較大劑量使用時對小鼠主要臟器無影響，說明中藥益生菌ZY安全無毒，無一般毒性。

對小鼠肝臟進行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，細胞壁均勻，細胞核清晰，可見清晰的肝小葉和排列整齊的肝索(圖1-A)。低、中、高劑量組小鼠肝組織病理切片結(jié)構(gòu)完整，可以清晰地看到肝小葉，肝索呈放射狀，均未見肝細胞損傷和炎癥反應(yīng)，未見肝細胞變性和壞死(圖1-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對小鼠肝組織無損傷作用，說明中藥益生菌ZY對小鼠肝組織無毒性作用。

注:A.空白組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組;下同。

圖1 中藥益生菌ZY對小鼠肝臟組織病理變化的影響

Fig.1 Effect of Chinese medicine and probiotics ZY on liver histopathology in mice

圖2 中藥益生菌ZY對小鼠腎臟組織病理變化的影響

對小鼠腎臟進行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠腎單位數(shù)量、大小和分布未見異常改變，腎小球未見異常改變，腎小管上皮未見腫脹，遠曲小管和集合管未見異常(圖2-A)。低、中、高劑量組小鼠腎小球大小正常，形狀形態(tài)規(guī)整，腎間質(zhì)未見炎癥浸潤，系膜區(qū)無可見增生情況(圖2-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對小鼠腎臟無損傷作用，說明中藥益生菌ZY對小鼠腎臟組織無毒性作用。

圖3 中藥益生菌ZY對小鼠脾臟組織病理變化的影響

對小鼠脾臟進行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠脾臟被膜未見異常，脾血竇內(nèi)的血細胞和巨噬細胞數(shù)目正常(圖3-A)。低、中、高劑量組小鼠脾臟被膜與空白組無異，脾血竇內(nèi)的血細胞和巨噬細胞數(shù)目未見異常增多或減少，脾小體淋巴細胞未見損傷，未見瘀血或出血(圖3-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對小鼠脾臟毒損傷作用，說明中藥益生菌ZY對小鼠脾臟無毒性作用。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果

中藥益生菌ZY小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率結(jié)果見表3。

本試驗通過計算小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核出現(xiàn)率，判斷化合物的致突變作用，微核率以千分率計。由表3可知，中藥益生菌ZY低、中、高劑量組微核率與空白組相比,差異不顯著(P>0.05)，與陽性組相比,差異極顯著(P<0.01)。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗的陰性結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率增加的作用，說明其無致小鼠體細胞染色體損傷的作用。

表3 中藥益生菌ZY對小鼠骨髓紅細胞微核率的影響

2.4 小鼠精子畸形試驗測定結(jié)果

中藥益生菌ZY小鼠精子畸形率結(jié)果見表4。

觀察并計數(shù)無勾、胖頭、尾折疊等類型的畸形精子數(shù)，分別計算各組精子畸形發(fā)生率，精子畸形率以百分?jǐn)?shù)計，中藥益生菌ZY試驗組精子畸形率與空白組相比,差異不顯著(P>0.05)，與陽性組相比,差異極顯著(P<0.01)。小鼠精子畸形試驗的陰性結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無明顯誘發(fā)小鼠精子畸形率增加的作用，說明其無致小鼠生殖細胞突變作用，無遺傳毒性。

表4 中藥益生菌ZY對小鼠精子畸形率的影響

3 討論與結(jié)論

毒理學(xué)安全性評價是藥物過渡到臨床使用的主要依據(jù)，通過連續(xù)反復(fù)給藥，觀察實驗動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)及臟器病理學(xué)改變等分析藥物的一般毒性和遺傳毒性[29]。本試驗通過小鼠最大耐受量、亞急性毒性、骨髓紅細胞微核及精子畸形試驗對中藥益生菌ZY進行毒理學(xué)安全性評價。

通過測定最大耐受量來反映中藥益生菌ZY的毒性情況。在藥物最大濃度和小鼠最大給藥量的條件下，未導(dǎo)致小鼠死亡，且所有受試小鼠均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，剖檢觀察小鼠主要臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生異常變化，根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，中藥益生菌配伍制劑屬于無毒性物質(zhì)。亞急性毒性是介于急性毒性和慢性毒性之間的一種毒性表現(xiàn)，亞急性毒性試驗旨在判斷動物接觸藥物時間較長時，對機體引起結(jié)構(gòu)或功能的損害作用。試驗動物的體重變化是反映動物機體中毒效應(yīng)和毒物毒性的最基本指標(biāo)，臟器指數(shù)是小鼠臟器與體重之比，能在一定程度上反應(yīng)臟器損傷的程度，當(dāng)臟器腫大時，臟器指數(shù)升高，當(dāng)臟器萎縮時，臟器指數(shù)降低，是提供受試化合物靶器官的重要指標(biāo)[30-32]。中藥益生菌ZY各劑量組小鼠均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，精神狀態(tài)均正常，高劑量組小鼠體重與空白組相比,差異極顯著，剖檢肝、腎等主要器官均無明顯病變，臟器指數(shù)與空白組相比,差異不顯著，觀察組織病理學(xué)切片顯示,肝、腎等主要臟器均無損傷。試驗結(jié)果說明，中藥益生菌ZY較長時間、較大劑量使用時對小鼠機體無損傷作用，并且能夠以劑量依賴性的方式促進小鼠體重的增加。試驗結(jié)果進一步表明，中藥益生菌ZY安全無毒。

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核和精子畸形試驗判斷藥物的致突變性和遺傳毒性是藥物安全性評價的重要內(nèi)容。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗是檢測外源化學(xué)物質(zhì)對染色體損傷作用的一種遺傳毒性試驗方法，是評價細胞遺傳學(xué)損傷、檢測染色體異常最簡便的方法，常用微核率作為評價致突變作用的指標(biāo)[33-34]。通過測定小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率判斷中藥益生菌配伍制劑致小鼠體細胞突變作用，以此評價該藥物的體細胞遺傳毒性。精子畸形試驗常用來檢測藥物的生殖毒性和對生殖細胞的致突變性，具有操作方便、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。通過小鼠精子畸形率判斷中藥益生菌ZY對小鼠生殖細胞的致突變作用，以此評價該藥物的生殖細胞遺傳毒性。本試驗結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對小鼠體細胞和生殖細胞未產(chǎn)生致突變作用，即中藥益生菌ZY無致突變作用，無遺傳毒性。

綜上所述，急性毒性、亞急性毒性和遺傳毒性試驗結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無一般毒性、致突變性和遺傳毒性，這為該藥物的合理應(yīng)用和開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。