權伍榮， 夏 炎， 管曉輝， 董 然， 沈明浩*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.Mazz.)別名婆婆丁、黃花地丁、黃花苗等，為菊科蒲公英屬多年生草本植物[1]。我國蒲公英種類有70多種，東北占有11種，在各地區(qū)分布廣泛，其中內蒙、東3省、甘肅等地生長居多，主要生長在山坡草地、路旁及田野處[2]。蒲公英在藥物、食品、飼料等方面的應用普遍，并具有一定的觀賞價值[3]，因其具有利膽、利尿和抗炎等藥用價值而長期被用于民間醫(yī)藥治療肝臟疾病和一些婦科疾病，如乳腺癌和子宮癌等[4-5]。

炎癥是由白細胞、細胞和肥大細胞產生的各種不同信號分子介導的復雜的病理生理過程[6]，表現為對組織損傷的一種防御反應，其表現為血流量增加導致組織溫度升高、發(fā)紅、腫脹和疼痛[7-8]?？赏ㄟ^各種不同的刺激引發(fā)，包括物理損傷，化學品，微生物的入侵和免疫反應[9-11]。在炎癥性疾病中有許多發(fā)炎癥介質參與并發(fā)揮重要作用，如一氧化氮(NO)、前列腺素(PG)E2和促炎細胞因子，腫瘤壞死因子TNF-α及白細胞介素IL-6等，用來消除有害刺激，以及愈合和修復受損組織的過程。越來越多的證據表明，炎癥介質失調與多種疾病的發(fā)病有關，包括充血性心力衰竭(CHF)、冠狀動脈粥樣硬化(AS)和阿爾茨海默病(AD)等[12-15]。

現今，西藥仍是常用的抗炎藥物，即甾體類抗炎藥如地塞米松、氫可的松等和非甾體類抗炎藥如阿司匹林、保泰松等，雖然西藥抗炎效果明顯，但副作用也極大，長期服用會造成肝腎、胃腸損傷等副作用。因此，尋找副作用低且效果明顯的抗炎抗免疫的中藥已成為熱門的研究方向。

該試驗以長白山野生蒲公英為原料，提取蒲公英皂苷并純化，以LPS刺激小鼠RAW264.7細胞建立體外炎癥模型，對蒲公英皂苷的抗炎效果及其相關作用機制進行研究，為今后有關蒲公英皂苷的抗炎及其機理的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7小鼠巨噬細胞為軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所劉文森研究員惠贈。

LPS、MTT(美國Sigama公司)；DMSO(北京化工廠)；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司)；TNF-α、IL-6細胞因子ELISA試劑盒(美國BioLegend公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、鼠二抗、兔二抗[生工生物工程(上海)股份有限公司]；細胞蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(長春鼎國生物科技公司)；β-肌動蛋白(ab8226)、IκB-α、P-IκB單克隆抗體(英國Abcam公司)；魯米諾化學發(fā)光試劑盒(美國CE公司)。其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋(日本Hirayama公司)；BB150型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Sorvall Legend Micro 21型高速冷凍離心機(德國Thermo公司)；DW-86L386型超低溫冰箱、HR40-ⅡA2型生物安全柜(青島海爾有限公司)；G1000基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；Infinite F500型多功能高端酶標儀(奧地利Tecan公司)；Trans-Blot SD型轉印槽(美國Bio-Rad公司)；AlphaImager HP高端凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Lnnotech公司)；CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 蒲公英粗皂苷的提取

取200 g蒲公英全草放入50 ℃干燥箱內烘干，用超微粉碎機將烘干后的蒲公英進行粉碎，再制成約35 g的蒲公英粉末濾紙包，添加8倍量的95%乙醇溶液浸泡處理1 h，加熱回流提取1 h，過濾；重復3次后合并濾液,再將濾液通過旋轉蒸發(fā)使其濃縮，回收乙醇。將得到的濃縮液通過石油醚萃取脫脂，再用正丁醇萃取得到的水相部分，最后用旋轉蒸發(fā)儀濃縮合并的提取液至500 mL，備用。

1.3.2 蒲公英皂苷的純化

試驗采用D101型大孔吸附樹脂對蒲公英皂苷進行純化,先用95%的乙醇將D101型大孔吸附樹脂浸泡24 h，采用濕法裝柱，將樹脂用95%的乙醇沖洗直至不產生白色混濁并且流出液與水混合比例為1∶2，最后用大量水沖洗，直至沒有乙醇味為止。樹脂用量為8倍的皂苷上樣量。先用蒸餾水洗脫，然后用70%的乙醇洗脫，洗脫流速2 mL/min，收集洗脫液并濃縮。

1.3.3 皂苷含量測定中標準曲線的繪制

分別移取0.2 mg/mL的人參皂苷Rb1標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于7支試管中，加水至2.0 mL。在535 nm處測吸光值，以人參皂苷標準品濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，計算得出回歸方程為：

y = 24.82x-0.000 24，R2=0.998 0。

1.4 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7 細胞用含8% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 MTT

將RAW264.7細胞，加入細胞濃度為7×104個/mL于96孔板中，每孔100 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸去原培養(yǎng)液，根據實驗設計加入不同濃度的蒲公英皂苷溶液，每孔100 μL，設4個復孔，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，取出加入10 μL濃度為5 μg/μL的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去原培養(yǎng)液，加入100 μL/mL DMSO，搖床搖晃5～10 min，于490 nm處測定各孔吸光值(OD 值)。

1.6 Griess reagent法測定NO的含量

試驗將蒲公英皂苷濃度設置為5個組別，分別為空白對照組、LPS(100 ng/mL)、低劑量組(125 μg/mL)、中劑量組(250 μg/mL)和高劑量組(500 μg/mL)，且將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于6孔板(5×105個細胞/mL)中并培養(yǎng)過夜。對照組分別向每孔中加入1 mL不同終濃度蒲公英皂苷(125、250、500 μg/mL)和 LPS(100 ng/mL)的混合液，并設 LPS組(LPS終濃度為100 ng/mL)和空白對照組(只加培養(yǎng)液)對照孔，每組3個復孔。各藥物組加入藥物1 h后再加入LPS共同培養(yǎng)24 h。

1.7 RT-PCR

將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于6孔板(5×105個細胞/mL)中并進行過夜培養(yǎng)。分別向每孔中加入1 mL不同終濃度蒲公英皂苷(125、250、500 μg/mL)和 LPS(100 ng/mL)的混合液，并設LPS組(LPS終濃度為100 ng/mL)和空白對照組(只加培養(yǎng)液)對照孔，每組3個復孔。處理24 h后收集細胞，利用UNIQ-10柱式Trizol法提取總RNA。采用Primer Premier 5軟件進行引物設計，并由上海生工生物有限公司合成引物，如表1所示。按反轉錄試劑盒進行逆轉錄，然后進行PCR，產物經電壓為110 V，時間為 25 min，瓊脂糖凝膠的濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳后，對電泳結果進行分析，測定TNF-α、IL-6、INOS mRNA的表達含量。退火溫度分別為：INOS 58 ℃；TNF-α58 ℃；IL-6 59 ℃；β-actin 55 ℃。

表1 TNF-α，IL-6、INOS，β -actin引物序列

1.8 Western blot檢測p-IκB和IκB-α的表達

將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于60 mm的單孔板(1×107個細胞/mL)中進行過夜培養(yǎng)。分組與給藥同方法1.6，培養(yǎng)4 h后收集細胞，提取總蛋白，根據Western blot測定蛋白含量。根據所提取蛋白的大小進行制膠，點樣，跑膠，對所需蛋白膠切取后進行轉膜、封閉、洗膜，將清洗后的膜放入含有一抗的密封袋中，放置在搖床上，4 ℃孵育過夜。一抗孵育完取出膜放入含有1×PBST的平皿中洗脫5次，每次5 min，取出PVDF膜后加入HRP標記的二抗，在室溫中孵育1 h后取出膜再用1×PBST每15 min洗滌1次，共洗滌5次。洗完后取出PVDF膜，用ECL化學發(fā)光試劑盒進行發(fā)光，放入儀器中掃描。

1.9 ELISA測定TNF-α和IL-6分泌量

取對數生長期的RAW264.7細胞接種于24孔板(5×105個細胞/mL)，培養(yǎng)過夜。分組與給藥方法方法同1.6，培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液，通過TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試劑盒(BioLegend)說明書對上清液中的TNF-α、IL-6的濃度進行檢測。

1.10 統(tǒng)計學處理

數據均采用means±SD表示，數據間差異顯著性采用SPSS17.0軟件中的t-test檢驗完成，*P<0.05代表組間差異顯著，**P<0.01代表組間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 MTT檢測蒲公英皂苷的細胞活性

設定8個蒲公英皂苷濃度(0，31.25，62.5，125，250，500，1 000 μg/mL)作用于 RAW264.7細胞，結果見圖1。蒲公英皂苷濃度在0～1 000 μg/mL，對 RAW264.7細胞活性沒有影響，故選擇濃度125、250、500 μg/mL為蒲公英皂苷的低、中、高劑量。

圖1 蒲公英皂苷對RAW264.7細胞活性的影響

2.2 蒲公英皂苷對LPS刺激的小鼠RAW264.7 細胞分泌NO的影響

由圖2可以看出，與空白對照組相比，100 ng/mL的LPS單獨作用RAW264.7細胞24 h后，能極顯著提高NO的分泌量(P<0.01)。蒲公英皂苷預處理細胞1 h后，與LPS對照組相比，蒲公英皂苷中、高劑量組均能極顯著的降低NO的分泌量(P<0.01)，而蒲公英皂苷的低劑量組與LPS對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

注：與空白對照組相比,##表示P<0.01;與LPS對照組相比,**表示P<0.01。

Fig.2 Effect oftaraxacumsaponin on LPS-induced the secretion of NO in RAW264.7 cells

2.3 蒲公英皂苷對LPS刺激的小鼠RAW264.7 細胞TNF-α、IL-6和INOS mRNA表達的影響

根據RT-PCR結果(圖3)可知，在LPS刺激RAW264.7細胞24 h后，與空白組相比，其IL-6、TNF-α、INOS mRNA表達水平有顯著提高(P<0.01)，蒲公英皂苷呈劑量依賴關系抑制IL-6、TNF-α、INOS mRNA的表達。與模型組相比較，中、高劑量組對IL-6 mRNA的表達有極顯著的抑制作用(P<0.01)，而低劑量組有顯著抑制作用(P<0.05)。低、中劑量組對TNF-α mRNA的表達抑制作用顯著(P<0.05)，而高劑量組的抑制作用極顯著(P<0.01)。低、中、高劑量組對INOS mRNA的表達均有一定的抑制作用，高、中劑量組的作用極顯著(P<0.01)，低劑量組有顯著抑制作用(P<0.05)。

注：與空白對照組相比，##表示P<0.01;與LPS對照組相比,*表示P<0.05， **表示P<0.01。

2.4 蒲公英皂苷對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞P-IκB和IκB-α蛋白表達的影響

根據Western blot結果可知(圖4)，小鼠RAW264.7細胞經LPS刺激4 h后，與空白組相比較，IκB-α蛋白的表達量明顯降低，并且在加入蒲公英皂苷后，中、高劑量組的IκB-α表達量顯著增加(P<0.001)；LPS組p-IκB-α的表達顯著增高，蒲公英皂苷呈劑量依賴關系抑制p-IκB-α蛋白的表達。與LPS組相比，蒲公英皂苷低劑量組中p-IκB-α蛋白表達顯著降低(P<0.05)，中、高劑量組的抑制作用極顯著(P<0.01)。提示蒲公英皂苷可以有效抑制IκB-α的磷酸化。

注：與空白對照組相比，##表示P<0.01;與LPS對照組相比,**表示P<0.01,*表示P<0.05，下同。

2.5 蒲公英皂苷對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞TNF-α和IL-6分泌的影響

根據ELISA結果(圖5)可知，單獨使用脂多糖刺激小鼠RAW264.7細胞24 h后，與空白對照組相比，TNF-α水平顯著升高。但加入不同劑量蒲公英皂苷后，TNF-α濃度水平均極顯著降低，且呈劑量依賴關系(P<0.01)。根據ELISA結果可知(圖6)，單獨用脂多糖刺激小鼠RAW264.7細胞24 h后，與空白組相比較，IL-6水平顯著升高。但是，加入不同劑量蒲公英皂苷后，IL-6濃度水平均又顯著降低，且呈劑量依賴關系(P<0.05或P<0.01)，在中、高劑量組中，下降極顯著(P<0.01)，在低劑量組中下降顯著(P<0.05)。

圖5 蒲公英皂苷對LPS刺激的RAW264.7細胞TNF-α分泌的影響

圖6 蒲公英皂苷對LPS刺激的RAW264.7細胞IL-6分泌的影響

3 討論與結論

LPS是由革蘭氏陰性菌釋放的一種內毒素，是單核細胞和細胞的有效誘導劑，是天然免疫應答的關鍵介質，由脂質A、核心寡糖和1個O側鏈組成，其中，脂質A是內毒素的主要成分。由LPS刺激的RAW264.7細胞會發(fā)生細胞內信號傳遞，最終導致細胞因子和其他炎癥介質的構成，進而有助于促炎性反應的產生和分泌。脂多糖在發(fā)病機制中被公認為是革蘭陰性膿毒癥與感染性休克。 LPS激活單核吞噬細胞(單核細胞和細胞)和其他類型的細胞分泌TNF-α，IL-6和其他細胞因子，介導各種炎癥性疾病的發(fā)展[16-19]。

RAW264.7細胞作為一種先天免疫細胞，當細胞保護身體免受外來入侵時，它會引發(fā)炎癥和免疫反應。當被LPS刺激的同時，細胞被激活并釋放多種促炎和細胞因子，過度的釋放將導致廣泛的組織損傷和病理變化。在這個過程中，細胞會產生許多炎癥介質，例如IL-6、TNF-α、NO和前列腺素。但過量介質的產生將會導致各種生理障礙，包括腫瘤的形成，自身免疫反應與炎癥類疾病[20-23]。

NO是炎癥發(fā)病機理中常見的一類促炎癥介質。哺乳動物細胞必須通過特定的誘導因子如炎癥引發(fā)細胞因子和細菌脂多糖來表達誘導型一氧化氮合酶(INOS)。INOS參與了炎癥[21]，而NO是由INOS釋放的重要細胞信號分子和炎性介質，在異常條件下因過度釋放引發(fā)的炎癥發(fā)病機制中起重要作用[22]，因此，INOS的抑制與抗炎作用有著密切的聯系。當LPS刺激RAW264.7細胞時，TNF-α、IL-6、INOS的表達會有所增加，并且細胞釋放的NO濃度也會相應升高[23]?；罨募毎尫懦鰜淼腎L-6、 TNF-α和INOS等促炎因子和細胞因子，可用于評估LPS誘導的細胞活化的潛在抗炎特性[24]。本研究表明，蒲公英皂苷可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞合成NO，并且還可以抑制INOS mRNA的表達，結果顯示了蒲公英皂苷可通過抑制NO的合成而發(fā)揮抗炎作用[24-26]。

IL-6是一種多效性細胞因子，通常在組織部位中產生并釋放到循環(huán)系統(tǒng)中而造成穩(wěn)態(tài)擾動，進而引起內毒素肺損傷、急性感染等。它除了主要參與產生免疫應對慢性細胞內感染，并且將IL-6連同其他細胞因子如TNF-α、IL-1一起循環(huán)，進而造成一些急性期反應，包括發(fā)熱，皮質酮釋放，肝生產的急性期蛋白，其中許多是蛋白酶抑制劑?？傮w來說，通過對這些急性反應誘導釋放的IL-6被認為是保持體內穩(wěn)態(tài)的一部分。本文通過RT-PCR以及ELISA方法對LPS誘導RAW24.7細胞的TNF-α和IL-6 mRNA的表達極其分泌情況進行了研究。由RT-PCR結果可以看出，不同濃度的蒲公英皂苷與RAW264.7細胞共同孵育24 h后，LPS誘導的TNF-α和IL-6基因的表達明顯下降，且呈劑量依賴關系。ELISA試驗結果表明，不同濃度的蒲公英皂苷與RAW264.7細胞共同孵育24 h后，細胞上清液中的TNF-α和IL-6的分泌量呈劑量依賴性下降。這些結果均可證明，蒲公英皂苷可通過降低TNF-α和IL-6的表達來抑制炎癥[27-29]。

細胞被LPS刺激引起炎癥反應后，2種主要的下游信號通路核轉錄因子κB (Nuclear Factor-kappaB，NF-κB)信號轉導通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)以及Janus激酶-信號轉導轉錄激活因子(Janus kinase-signal transduction andtranscription activation，JAK-STAT)信號轉通路會參與到調控LPS的炎癥反應中。NF-κB在調節(jié)免疫及炎癥過程中起著至關重要的作用，進而成為發(fā)展為炎癥性疾病的新的治療目標[25-31]。所以，可以通過抑制NF-κB信號轉導通路來作為抗炎藥物的靶點。因此，本文通過研究蒲公英皂苷影響IκB的磷酸化，以確定其是否抑制NF-κB信號通路的活化，進而減少促炎細胞因子和炎癥介質的生成[30-31]。經過前面的試驗已經可以證明，蒲公英皂苷能夠使LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α和IL-6的數量下降，并抑制TNF-α、IL-6和INOS 的mRNA表達，但是否也是通過調節(jié)NF-κB信號轉導通路得以實現還需要進一步證明。因為檢測IκB-α即可間接檢測蒲公英皂苷對NF-κB的抑制作用，因此，本研究對蒲公英皂苷影響 NF-κB的表達進行了研究。通過試驗可以發(fā)現，在LPS的誘導下，細胞蛋白中的IκB-α的數量明顯減少，但隨著蒲公英皂苷的濃度的增加，IκB-α的量呈劑量依賴性增加；P-IκB則恰好相反，單獨LPS刺激下使得P-IκB的量顯著增加，但加入蒲公英皂苷后，隨著蒲公英皂苷濃度的增加，p-IκB的量卻呈劑量依賴性降低。這就說明IκB-α受到LPS的刺激后發(fā)生磷酸化轉變成活性狀態(tài)的p-IκB，這也進一步的表明蒲公英皂苷至少部分通過抑制IκB-α的磷酸化而阻斷NF-κB通路從而發(fā)揮抗炎作用。但是關于蒲公英皂苷是否也通過抑制MAPKs和JAK-STAT信號轉導通路而發(fā)揮抗炎作用還有待于進一步研究。

綜上所述，蒲公英皂苷能夠通過阻斷NF-κB的信號通路，抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NO的合成和INOS基因的表達，以及抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表達和TNF-α、IL-6的分泌量，從而發(fā)揮體外抗炎的有效作用，這為進一步深入研究蒲公英皂苷對細胞的體外抗炎活性而奠定基礎。