韓曉東，郭榮起，高 陽(yáng)，于秀敏，蘇 杰，張子義，李國(guó)婧，王瑞剛

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 2. 呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650 ；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109)

質(zhì)子泵是氧化磷酸化過(guò)程中合成ATP的能量系統(tǒng)，存在于幾乎所有的真核細(xì)胞內(nèi)。植物液泡質(zhì)子泵(V-ATPase)最早發(fā)現(xiàn)于液泡中，是一種由13個(gè)亞基組成的多亞基復(fù)合體酶，由V1和V02個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成類(lèi)似“球莖”的結(jié)構(gòu)[1]。其中，V1域突出膜外，由A～H共8個(gè)亞基構(gòu)成。V0域鑲嵌于膜內(nèi)，由a、c、c′、e和d共5個(gè)亞基組成[2]。

在對(duì)V-ATPase各亞基的研究中，c亞基備受關(guān)注，它與酵母Vma3p的c亞基同源。分子質(zhì)量約為16 ku，是形成V0膜域的主要組件。同時(shí)，也是質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，與H+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[3]。此外，c亞基對(duì)V1與V0結(jié)構(gòu)域的裝配也是必不可少的。有報(bào)道稱(chēng)c亞基是細(xì)胞通訊中間隙聯(lián)結(jié)的部分，是神經(jīng)遞質(zhì)釋放介導(dǎo)體的組分，也是某種罕見(jiàn)的病毒癌基因產(chǎn)物的靶蛋白[4]。c亞基在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物處于逆境環(huán)境中，V-ATPase 能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及植物體內(nèi)數(shù)量的改變來(lái)適應(yīng)環(huán)境的改變，從而降低逆境對(duì)其造成的傷害[5-7]。在高鹽、寒冷、干旱等環(huán)境下，山墻蘚(Tortularuralis)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、二色補(bǔ)血草(Limoniumbicolor)中的V-ATPase轉(zhuǎn)錄水平和活性都明顯提高[8-9]。Xu等[10]將二色補(bǔ)血草的VHA-c1基因在煙草(NicotianatabacumL.)中過(guò)表達(dá)后，可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽脅迫的耐受能力，研究認(rèn)為這是由于轉(zhuǎn)基因株系中超氧化物歧化酶與過(guò)氧化物酶被顯著激活，能夠有效地清除細(xì)胞內(nèi)的氧化物質(zhì)，使細(xì)胞膜不被氧化達(dá)到保護(hù)細(xì)胞完整性的作用、進(jìn)而提高細(xì)胞耐受高鹽環(huán)境的能力。

為了更深入地了解擬南芥VHA-c1基因的功能，本研究利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了VHA-c1基因沉默的轉(zhuǎn)基因純合株系，并對(duì)其純合體進(jìn)行了鹽脅迫、外源ABA和糖處理，旨在為進(jìn)一步探明VHA-c1基因在植物非生物脅迫方面的抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

根癌農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α、pHANNIBAL載體、pART27載體和擬南芥(Columbia，Col-0)由內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥培養(yǎng)條件：22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度60%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1VHA-c1基因沉默載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 采用CTAB法[11]提取擬南芥基因組DNA，以其為模板PCR擴(kuò)增VHA-c1目的片段。正義鏈(Sense)特異引物為c1-s-5和c1-s-3，反義鏈(Anti-sense)特異引物為c1-as-5和c1-as-3，具體的引物序列與引入的酶切位點(diǎn)見(jiàn)表1。凝膠純化回收PCR產(chǎn)物，利用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的方法將正義鏈和pHANNIBAL載體連接，測(cè)序鑒定正確命名為pHAN-c1-s。同理，利用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切方法將反義鏈與pHAN-c1-s載體相連接，測(cè)序鑒定正確命名為pHAN-c1-s-as。最后，用NotⅠ單酶切pHAN-c1-s-as質(zhì)粒，回收包含35S啟動(dòng)子、ocs終止子、c1-s和c1-as片段，并與經(jīng)NotⅠ酶切pART27載體的回收片段相連接，測(cè)序正確的重組表達(dá)載體命名為pART-c1。

將pART-c1載體用電擊法[12]轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞中，在含25 μg/mL慶大霉素和100 μg/mL放線(xiàn)菌素的固體培養(yǎng)基平板上篩選陽(yáng)性克隆。用c1-s-5或c1-as-3為引物，進(jìn)行菌落鑒定，鑒定為陽(yáng)性的保種，用于下一步轉(zhuǎn)化植物。

1.2.2VHA-c1基因沉默植株的篩選及純系的獲得 擬南芥的轉(zhuǎn)化采用浸花法[13]，轉(zhuǎn)化后將擬南芥在正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)21～28 d，收取成熟種子。將種子播種于含30 μg/mL卡那霉素的1/2 MS選擇培養(yǎng)基中，22 ℃培養(yǎng)10～12 d后挑選陽(yáng)性植株，待其成熟后分單株收取種子(T1)；T1種子按單株種于含30 μg/mL卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，選擇有1/3性狀分離的株系，將綠苗移至蛭石上培養(yǎng)，單株收取種子(T2)；T2種子按單株在含30 μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，不再分離的即為純合體株系，用于各項(xiàng)指標(biāo)的分析。

1.2.3 RT-PCR半定量VHA-c1基因沉默效果 提取擬南芥野生型(CK)和VHA-c1基因沉默株系總RNA[14]，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，分別以c1-RT-F和c1-RT-F為引物PCR擴(kuò)增VHA-c1，以actin-RT-F和actin-RT-R為引物擴(kuò)增內(nèi)參基因actin(At3g12110)。將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析結(jié)果。

1.2.4 基因沉默株系c1-1的脅迫處理與表型分析 擬南芥野生型和VHA-c1基因沉默株系種子同時(shí)種在1/2 MS 培養(yǎng)基中，4 ℃春化 3 d，22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng) 5 d后，同時(shí)分別轉(zhuǎn)移到含有0，25，50，100 mmol/L NaCl和含有0，4，8，12 μmol/L ABA的 1/8 MS 的平板上，光下豎直放置4 d，記錄主根相對(duì)伸長(zhǎng)量。

野生型和VHA-c1基因沉默株系種子同時(shí)種在含有50 mmol/L NaCl及6%葡萄糖的 1/2 MS 培養(yǎng)平板上，4 ℃春化3 d。然后，在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng) ，此刻計(jì)時(shí)為0 h，并再后續(xù)的24，48，72，96 h時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。

表1 特異性引物與酶切位點(diǎn)Tab.1 The specific primers sequences and restriction sites

2 結(jié)果與分析

2.1 VHA-c1基因沉默株系的篩選與鑒定

基因沉默質(zhì)粒pART-c1經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。經(jīng)過(guò)抗生素篩選，最終獲得了5株T2轉(zhuǎn)基因純合株系，分別命名為c1-1、c1-2、c1-3、c1-4、c1-5。分別提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用半定量RT-PCR技術(shù)，分別擴(kuò)增actin基因和VHA-c1基因。微調(diào)凝膠電泳上樣量，在actin基因轉(zhuǎn)錄量相同的情況下，比較5株基因沉默株系與野生型的VHA-c1表達(dá)量。結(jié)果顯示：c1-1和c1-2株系的VHA-c1基因幾乎95%被沉默，而其他3株系都有不同程度的表達(dá)(圖1-A)。因此，選擇c1-1株系用于后續(xù)的功能試驗(yàn)。

由于VHA-c1～c5基因具有很高的序列同源性，對(duì)設(shè)計(jì)的siRNA-c1沉默片段特異性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：設(shè)計(jì)的基因沉默片段特異性非常好，它只對(duì)VHA-c1基因沉默，并不影響其他4個(gè)VHA-c2～c5基因的表達(dá)(圖1-B)。

2.2 NaCl處理VHA-c1基因沉默株系主根伸長(zhǎng)與種子萌發(fā)的變化

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)VHA-c1過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出很強(qiáng)的NaCl耐受性[15]。因此，為了進(jìn)一步明確VHA-c1基因與NaCl耐受性之間的關(guān)系，對(duì)基因沉默株c1-1在不同濃度NaCl下培養(yǎng)，測(cè)量其根相對(duì)伸長(zhǎng)量。結(jié)果表明：25，50，100 mmol/L的NaCl濃度下，VHA-c1基因沉默的株系的根相對(duì)伸長(zhǎng)量都小于野生型，特別是在NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)，VHA-c1基因沉默株系根伸長(zhǎng)量比對(duì)照減少12%(圖2-A)。

A.VHA-c1基因沉默株系中VHA-c1基因的表達(dá)水平檢測(cè);B. RNAi 突變純合體 c1-1 中VHA-c1基因沉默特異性檢測(cè); Control.野生型; c1-1～c1-5.轉(zhuǎn)基因植株。圖2-4同。

A.Detection ofVHA-c1mRNA expression in silenced homozygous plants by RT-PCR； B. Specificity detection ofVHA-c1silencing construct in homozygous line c1-1；Control. Wild type；c1-1-c1-5. Transgenic plants. The same as Fig.2-4.

圖1c1基因沉默株系中VHA-c1基因的表達(dá)水平與半定量RT-PCR檢測(cè)
Fig.1 Detection ofc1gene mRNA expression and specificityin silenced homozygous plants by semi-quantitative RT-PCR

A. 在含 NaCl 的培養(yǎng)基上 VHA-c1 基因沉默突變純合體根的相對(duì)伸長(zhǎng)量；B. VHA-c1 基因沉默突變純合體在 50 mmol/L NaCl 處理下的萌發(fā)率。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。A. Relative root growth of VHA-c1 silenced homozygous seedlings on MS containing different concentrations of NaCl； B.Germination rate of VHA-c1 silenced homozygous lines on MS containing 50 mmol/L NaCl.Different lowercase letter indicate significant differences (P<0.05).The same as Fig.3.

50 mmol/L NaCl對(duì)基因沉默株c1-1的種子萌發(fā)率結(jié)果表明：隨著NaCl處理時(shí)間的增加，VHA-c1基因沉默株系種子的萌發(fā)被嚴(yán)重的抑制(圖2-B)。綜上，VHA-c1基因與植物應(yīng)對(duì)NaCl脅迫具有直接的關(guān)系。

2.3 ABA處理VHA-c1基因沉默株系主根伸長(zhǎng)的變化

不同濃度ABA處理基因沉默株c1-1與野生型擬南芥，隨著ABA濃度的增加，c1-1和野生株的主根生長(zhǎng)被抑制的程度均增加。但是，相對(duì)于野生型擬南芥，基因沉默株的主根被ABA抑制的程度較小。特別是在4，8 μmol/L ABA濃度下，c1-1株系的主根相對(duì)伸長(zhǎng)量平均比野生株系分別長(zhǎng)32%，48%(圖3)。

圖3 ABA處理VHA-c1基因沉默株系根相對(duì)伸長(zhǎng)量的變化Fig.3 The relative root growth assay of VHA-c1 gene silenced homozygous plants under ABA stress

2.4 葡萄糖處理VHA-c1基因沉默株系種子萌發(fā)率的變化

通常在研究植物響應(yīng)ABA脅迫處理的過(guò)程中，也要研究植物響應(yīng)糖處理的試驗(yàn)，這是由于糖脅迫信號(hào)通路與ABA信號(hào)通路的相關(guān)性所致。本試驗(yàn)選擇了6%的葡萄糖作為糖脅迫材料，分別對(duì)擬南芥進(jìn)行24，48 ，72 ，96 h的脅迫處理。結(jié)果表明：從24 h后開(kāi)始，基因沉默株系c1-1種子的萌發(fā)率與野生型株系種子的萌發(fā)率在這4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上幾乎沒(méi)有明顯區(qū)別(圖4)。

圖4 葡萄糖處理VHA-c1基因沉默株系種子的萌發(fā)率Fig.4 The germination rates assay of VHA-c1 gene silenced homozygous plants under glucose stress

3 結(jié)論與討論

已有報(bào)道，V-ATPase通過(guò)c亞基表達(dá)量的變化，影響細(xì)胞擴(kuò)展[16]。其機(jī)制是V-ATPase利用液泡中ATP所釋放的能量將H+泵到液泡腔中，產(chǎn)生H+電化學(xué)梯度，使液泡酸化，為物質(zhì)運(yùn)輸提供能量，從而影響膨壓和細(xì)胞擴(kuò)增[17-18]。本研究利用高度特異性的RNA干擾技術(shù)，沉默VHA-c1基因，獲得了穩(wěn)定的擬南芥株系c1-1。

V-ATPase的一個(gè)重要功能就是將H+泵入膜內(nèi)的同時(shí)，伴隨著將Na+泵出膜外。多數(shù)植物種，隨著環(huán)境中NaCl濃度的提高，V-ATPase的轉(zhuǎn)錄水平與生物活性都有所增加。在筆者前期的研究中，過(guò)表達(dá)VHA-c1基因后，顯著提升過(guò)表達(dá)株系的NaCl耐受能力[19-20]。本研究將VHA-c1基因沉默后，在系列NaCl濃度梯度脅迫下沉默株系的根相對(duì)伸長(zhǎng)量與種子的萌發(fā)率都有明顯的降低，在濃度為50 mmol/L和100 mmol/L NaCl脅迫處理下，VHA-c1基因沉默株系的主根相對(duì)伸長(zhǎng)量被顯著抑制。這意味著VHA-c1亞基表達(dá)與其對(duì)NaCl脅迫的耐受性有著直接的關(guān)系。

脫落酸(ABA)作為一種重要的植物激素，參與植物胚胎發(fā)育、種子休眠、果實(shí)成熟等生理活動(dòng)；同時(shí)，它在植物抵抗非生物脅迫過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用[21-22]。用不同濃度的ABA處理VHA-c1基因沉默株系探究ABA 與VHA-c1的關(guān)系。結(jié)果表明，基因沉默和對(duì)照株系的幼苗都隨著ABA濃度的增加，它們的根相對(duì)伸長(zhǎng)量都在減小。VHA-c1基因沉默株系的根伸長(zhǎng)量均長(zhǎng)于對(duì)照株系。特別是在濃度為4，8 μmol/L ABA脅迫處理后，c1-1株系的主根相對(duì)伸長(zhǎng)量顯著(P<0.05)長(zhǎng)于野生株系的主根伸長(zhǎng)量。另外，VHA-c1基因沉默株系在含有6%的葡萄糖MS平板生長(zhǎng)時(shí)，其種子的萌發(fā)率和野生型株系的種子萌發(fā)率是相同的。這進(jìn)一步說(shuō)明VHA-c1基因?qū)BA的脅迫不敏感，這可能是因?yàn)镠+-ATPase在鹽脅迫信號(hào)通路和ABA信號(hào)通路中起著不同的調(diào)控功能。

綜上所述，本研究獲得了擬南芥VHA-c1基因特異性沉默株系，對(duì)其進(jìn)行NaCl、ABA處理后發(fā)現(xiàn)其表型與野生型不同，為進(jìn)一步研究VHA-c1基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)和抗逆境過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。