宋振君，李志勇，王永芳，全建章，馬繼芳，白 輝，董志平

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家谷子改良中心，河北 石家莊 050035；2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

谷子(Setariaitalica)起源于中國(guó)，具有悠久的種植歷史。谷子是一種抗旱耐瘠、糧草兼用、富含營(yíng)養(yǎng)的特色雜糧作物，可用于提升干旱地區(qū)糧食產(chǎn)量、發(fā)展畜牧業(yè)和改善人們膳食結(jié)構(gòu)[1-2]。谷子線蟲(chóng)病是華北谷子產(chǎn)區(qū)的重要病害，在河北中南部、山東、河南等夏谷區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重地塊可減產(chǎn)50%～80%，是當(dāng)前谷子高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一[3]。由于谷子種子調(diào)運(yùn)頻繁、抗病品種培育困難、主要栽培品種均為感病品種等因素影響，在我國(guó)谷子產(chǎn)區(qū)谷子線蟲(chóng)病蔓延的趨勢(shì)日益加劇[4]。谷子線蟲(chóng)病又稱(chēng)紫穗病或者倒青，病原菌為貝西滑刃線蟲(chóng)(AphelenchoidesbesseyiChristie, 1942)，是一種遷移性植物寄生線蟲(chóng)[5]。谷子線蟲(chóng)病的傳播主要依賴(lài)于帶病種子，線蟲(chóng)會(huì)伴隨著植株的生長(zhǎng)逐漸由植株的地下部分轉(zhuǎn)移到地上部分，主要為害花器、子房，影響穗的發(fā)育，造成谷子大量減產(chǎn)[3, 6]。

谷子線蟲(chóng)為種傳病害，應(yīng)從選種初期進(jìn)行篩選與防控，切斷傳播病害的源頭，因此對(duì)種子進(jìn)行帶線蟲(chóng)檢測(cè)尤為重要。崔麗麗等[7]采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板法和紙培養(yǎng)法，檢測(cè)到吉林省北五味子種子攜帶有青霉屬、曲霉屬和根霉屬病菌；趙芝等[8]對(duì)采自云南省的15份三七種子樣品，采用PDA平板法檢測(cè)到種子表面和內(nèi)部攜帶多種真菌；胡曉芬等[9]采用盆栽幼苗癥狀觀察法和PDA培養(yǎng)基法，對(duì)7個(gè)玉米品種進(jìn)行了種子表面帶菌檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到供試種子表面攜帶有4種真菌；高葦?shù)萚10]用洗滌法和PDA平板法，對(duì)12個(gè)黃瓜栽培品種進(jìn)行種子外部和內(nèi)部帶菌檢測(cè)，結(jié)果顯示供試種子外部帶菌量高于種子內(nèi)部寄藏真菌；金柳艷等[11]對(duì)黃淮海夏玉米區(qū)720個(gè)玉米籽粒樣品帶菌量進(jìn)行檢測(cè)，采用洗滌檢測(cè)法和PDA平板檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)表面無(wú)癥狀的玉米籽粒在成熟期均攜帶大量病原菌。目前，關(guān)于種子帶菌檢測(cè)的報(bào)道中很多試驗(yàn)者都采用PDA平板法[12]對(duì)籽粒的帶菌率與分離到菌屬的分離頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，且對(duì)分離得到的菌屬進(jìn)行分類(lèi)鑒定。此檢測(cè)方法在平板培養(yǎng)過(guò)程中易受雜菌的干擾，且鑒定結(jié)果還需要進(jìn)行再接種的生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步確定，如有大量的樣品需要檢測(cè)時(shí)，耗時(shí)費(fèi)力[13]。

由于滑刃屬線蟲(chóng)種類(lèi)繁多，形態(tài)特征復(fù)雜多變，且與其近似種十分相似，利用傳統(tǒng)方法對(duì)貝西滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，需要扎實(shí)的分類(lèi)鑒定功底，因此，傳統(tǒng)檢測(cè)方法有一定的局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速的發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子檢測(cè)技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速、簡(jiǎn)捷且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，已被用于種子中植物病原菌的檢測(cè)[13-21]。宋順華等[13]通過(guò)優(yōu)化PCR模板的方法，利用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，檢測(cè)出西瓜種子帶有細(xì)菌性果腐病菌；任毓忠等[22]采用特異性引物PCR技術(shù)檢測(cè)出8個(gè)市售哈密瓜品種的種子攜帶有瓜類(lèi)果斑病菌；曾丹丹等[23]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)黃淮地區(qū)29個(gè)大豆主栽品種種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)，檢測(cè)出多種病原菌；張貴等[24]利用巢氏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，檢測(cè)出向日葵種皮中攜帶有黃萎病菌。在種子帶菌檢測(cè)中PCR的方法呈現(xiàn)出快速、簡(jiǎn)捷且鑒定結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，因此可用于谷子種子帶菌的檢測(cè)。在谷子中利用PCR技術(shù)檢測(cè)種子攜帶線蟲(chóng)的報(bào)道還極少。因此，本研究以來(lái)自黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西和陜西等谷子主產(chǎn)區(qū)的99份谷子種子DNA為模板，使用已報(bào)道的1對(duì)貝西滑刃線蟲(chóng)PCR特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]，快速檢測(cè)谷子種子是否帶有貝西滑刃線蟲(chóng)，并分析線蟲(chóng)種群的單倍型數(shù)目和變異位點(diǎn)，旨在為谷子種子攜帶線蟲(chóng)進(jìn)行快速鑒定提供技術(shù)支持，為谷子線蟲(chóng)病的早期診斷與防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2018年4-8月在河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試的谷子線蟲(chóng)病穗，由河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所植保室保存；99份谷子種子來(lái)自黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西和陜西等國(guó)家谷子高粱產(chǎn)業(yè)體系育種崗位、試驗(yàn)站和種子公司，具體信息詳見(jiàn)表1。

表1 99份供試谷子品種編號(hào)及來(lái)源Tab.1 Numbers and origins of the 99 tested foxtail millet varieties

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷子種子基因組DNA的提取 使用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP321-03)提取谷子種子基因組DNA，試驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。分別采用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop方法檢測(cè)DNA樣品的完整性、純度和濃度，選擇合格的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 引物的特異性檢測(cè) 采用已報(bào)道的根據(jù)貝西滑刃線蟲(chóng)核糖體28S rRNA-D2/D3片段設(shè)計(jì)的特異性引物[21]：GU-F(GACACTGCAATCGCTTCGAC)/GU-R(ATCCGCAACCACAACTCACA)，以谷子貝西滑刃線蟲(chóng)和其他4種谷子籽粒上常見(jiàn)的病原菌：谷子銹菌(Uromycessetariae-italicae)、谷瘟病菌(Pyriculariasetariae)、白發(fā)病菌(Sclerosporagraminicola)和粟粒黑穗病菌(Ustilagocrameri)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物的特異性。PCR反應(yīng)體系為25 μL，2 × Es Taq Master Mix 12.5 μL(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0690)、模板DNA 2.0 μL、上下游引物各1 μL(濃度10 μmol/L)、超純水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 2 min；35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳緩沖液為1×TAE，恒定電壓160 V，電泳20 min，用EB染色并在紫外凝膠成像儀上觀察電泳條帶并且拍照。

1.2.3 引物的靈敏度檢測(cè) 將谷子線蟲(chóng)DNA用滅菌超純水稀釋為初始質(zhì)量濃度10 ng/μL，按(1，1/10，1/20， 1/40，1/80，1/160)共6個(gè)濃度梯度，分別稀釋成10.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.062 5 ng/μL。以不同濃度的DNA為模板，采用PCR檢測(cè)體系進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)特異性引物的靈敏度。

1.2.4 28S核糖體RNA序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序 利用貝西滑刃線蟲(chóng)特異性引物GU-F/GU-R對(duì)谷子種子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 2 min；35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s)，72 ℃延伸5 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收目的條帶。按照凝膠DNA小量回收試劑盒(美基生物科技有限公司，D2111-03)的步驟將切膠回收的目的片段與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，把經(jīng)菌落PCR篩選的陽(yáng)性克隆菌液送至上海生工測(cè)序。每個(gè)樣品測(cè)序3次，3次測(cè)序結(jié)果吻合的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用Sequencher_v4.1.4 軟件讀取測(cè)序的序列，觀察峰值進(jìn)行反復(fù)校對(duì)，利用DNAMAN_v6、ClustalX1.81[25]軟件對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行分析，并與從GenBank上下載貝西滑刃線蟲(chóng)28S核糖體RNA序列進(jìn)行多序列同源比對(duì)，分析單倍型數(shù)目和變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性檢測(cè)

利用谷子貝西滑刃線蟲(chóng)的特異性引物GU-F/GU-R，以谷子貝西滑刃線蟲(chóng)和4種谷子籽粒上常見(jiàn)的病原菌(谷銹菌、谷瘟病菌、白發(fā)病菌和粟粒黑穗病菌)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的特異性。結(jié)果如圖1所示，該引物僅能對(duì)谷子貝西滑刃線蟲(chóng)DNA擴(kuò)增出約245 bp的特異性片段，其他病原菌DNA與陰性對(duì)照(ddH2O)則無(wú)條帶出現(xiàn)。將特異性片段進(jìn)行回收純化和測(cè)序，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中貝西滑刃線蟲(chóng)的28S核糖體RNA序列(登錄號(hào)：KX622689.1)進(jìn)行比對(duì)分析，可知245 bp特異性片段的序列與貝西滑刃線蟲(chóng)序列完全匹配，說(shuō)明引物GU-F/GU-R能夠特異的檢測(cè)出谷子貝西滑刃線蟲(chóng)。

M.Marker；AB.谷子貝西滑刃線蟲(chóng)；US.谷銹菌；PS.谷瘟病菌；SG.白發(fā)病菌；UC.粟粒黑穗病菌；CK.陰性對(duì)照(ddH2O)。

M.Marker；AB.Aphelenchoidesbesseyi；US.Uromycessetariae-italicae；PS.Pyriculariasetariae；SG.Sclerosporagraminicola；UC.Ustilagocrameri；CK.Negative control(ddH2O).

圖1 貝西滑刃線蟲(chóng)特異性引物GU-F/R的檢測(cè)結(jié)果
Fig.1 Detection results ofAphelenchoidesbesseyispecific primerGU-F/R

2.2 引物的靈敏度檢測(cè)

利用谷子貝西滑刃線蟲(chóng)的特異性引物，以谷子線蟲(chóng)DNA稀釋后不同質(zhì)量濃度的DNA(10.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625ng/μL)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)特異性引物的靈敏度。結(jié)果如圖2，模板濃度為10 ng/μL時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且明亮。質(zhì)量濃度為1 ng/μL(1/10×)和0.5 ng/μL(1/20×)時(shí)，擴(kuò)增條帶依然清晰可見(jiàn)。稀釋至0.125 ng/μL(1/80×)時(shí)，條帶亮度下降，但仍可判別。質(zhì)量濃度為0.062 5 ng/μL(1/160×)時(shí)，特異性條帶基本消失。表明貝西滑刃線蟲(chóng)特異性引物對(duì)線蟲(chóng)DNA檢測(cè)靈敏度較高，即使DNA濃度較低時(shí)，仍保持較高的檢測(cè)效率。線蟲(chóng)DNA模板量為0.125 ng/μL是引物的最低檢測(cè)濃度。

M.Marker；1-6.(1×，1/10×，1/20×，1/40×，1/80×，1/160×)；CK.陰性對(duì)照(ddH2O)。M.Marker；1-6.(1×，1/10×，1/20×，1/40×，1/80×，1/160×)；CK. Negative control(ddH2O).

M.Marker；CK+.貝西滑刃線蟲(chóng)；CK-.ddH2O；C1～C99.品種編號(hào)。M.Marker；CK+. Aphelenchoides besseyi；CK-.ddH2O；C1-C99.Cultivar numbers.

2.3 谷子種子攜帶貝西滑刃線蟲(chóng)及其頻率的檢測(cè)

將采自黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西和陜西等地的99份谷子種子樣本進(jìn)行基因組DNA提取，利用PCR技術(shù)，對(duì)籽粒上的貝西滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，99份種子樣品中有33份擴(kuò)增出特異性條帶，陰性對(duì)照(ddH2O)無(wú)條帶。對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行TA克隆并選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與貝西滑刃線蟲(chóng)28S核糖體RNA序列(KX622689.1)進(jìn)行比對(duì)，除C40樣品的序列為97%以外，其他所有序列與其相似性為99%及以上。結(jié)果表明，本研究建立的PCR體系具有良好的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，可用于谷子種子中貝西滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)。

表2 不同地區(qū)谷子品種種子帶病頻率的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Contamination rate of different foxtail millet cultivars detected

為了確定谷子不同品種籽粒攜帶貝西滑刃線蟲(chóng)的頻率，對(duì)99份谷子種子的帶病率進(jìn)行了重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，33份谷子種子帶有貝西滑刃線蟲(chóng)，與之前檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性重復(fù)率100%。將33份陽(yáng)性谷子帶貝西滑刃線蟲(chóng)頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中，C93帶病率最高，為100%；C65、C66、C67和C77共4份谷子品種帶病率最低，僅為33.3%；其余供試的谷子種子帶病率介于二者之間(表2)。33份帶貝西滑刃線蟲(chóng)的谷子品種大部分來(lái)自春谷區(qū)(圖4)，在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、山西、河北張家口這些地區(qū)均檢測(cè)到，而來(lái)自海南的5份種子中檢測(cè)到2份帶貝西滑刃線蟲(chóng)。

三角形和圓形表示樣本所在地區(qū)，圓形表示具有陽(yáng)性樣本的地區(qū)；分?jǐn)?shù)表示該地區(qū)陽(yáng)性樣本數(shù)占樣本數(shù)的比值。

The triangle and round indicate the location of the sample, and the round indicates positive samples；The score represents the ratio of positive samples to the total samples in the area.

圖4 帶貝西滑刃線蟲(chóng)的谷子品種地理分布圖
Fig.4 Geographical distribution map of foxtail milletvarieties withAphelenchoidesbesseyi

2.4 貝西滑刃線蟲(chóng)28S核糖體RNA序列的分析

對(duì)33份陽(yáng)性種子攜帶的貝西滑刃線蟲(chóng)28S核糖體RNA序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果如表3所示。貝西滑刃線蟲(chóng)基因種內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)有29個(gè)，其中多變異位點(diǎn)3個(gè)，這些突變以A-G/T-C之間的轉(zhuǎn)換為主。貝西滑刃線蟲(chóng)種內(nèi)變異率為11.8%，基因中的GC含量為56.3%～57.1%，平均為56.7%，無(wú)明顯的堿基偏向性。

對(duì)33份貝西滑刃線蟲(chóng)樣本序列進(jìn)行分析，共檢測(cè)出22種單倍型，分別命名為AB1-AB22，并進(jìn)行單倍型的多樣性分析，結(jié)果如表4。其中單倍型AB1出現(xiàn)的頻率最高，在具有陽(yáng)性樣品的各省份中均可檢測(cè)到該單倍型。其余的單倍型僅出現(xiàn)過(guò)一次，屬于稀有單倍型。河北張家口和內(nèi)蒙古松山區(qū)兩地的遺傳多樣性最為豐富。

表3 貝西滑刃線蟲(chóng)樣本單倍型的變異位點(diǎn)Tab.3 Variation sites in haplotypes of Aphelenchoides besseyi

注：AB1-AB22.貝西滑刃線蟲(chóng)單倍型(AB1 GenBank 登錄號(hào)：KX622689.1；AB2-AB22 GenBank 登錄號(hào)：MK204592-MK204612)。

Note: AB1-AB22.Haplotypes ofAphelenchoidesbesseyi(GenBank accession number of AB1: KX622689.1; GenBank accession number of AB2 to AB22: MK204592-MK204612)．

表4 貝西滑刃線蟲(chóng)各地理種群?jiǎn)伪缎徒y(tǒng)計(jì)Tab.4 Phenotypic statistics in different geographical populations of Aphelenchoides besseyi

3 結(jié)論與討論

本研究利用PCR技術(shù)對(duì)谷子種子是否攜帶貝西滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行了檢測(cè)，這種快速檢測(cè)方法來(lái)自貝西滑刃線蟲(chóng)雙重PCR檢測(cè)體系[21]，該方法共設(shè)計(jì)2對(duì)引物：內(nèi)標(biāo)引物F194/AB28以及特異性引物GU-F/GU-R，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，能快速準(zhǔn)確鑒定出貝西滑刃線蟲(chóng)。本研究中，選擇其特異性引物GU-F/GU-R對(duì)谷子種子DNA進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與貝西滑刃線蟲(chóng)序列完全匹配；同時(shí)也選擇內(nèi)標(biāo)引物F194/AB28對(duì)種子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果有2條大小不同的條帶：其中750 bp條帶匹配谷子序列，780 bp條帶匹配假單胞菌屬序列，測(cè)序比對(duì)結(jié)果均不匹配線蟲(chóng)序列，這一結(jié)果與雙重PCR檢測(cè)體系結(jié)果并不一致。

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)所使用的PCR模板，是采用CTAB方法從帶菌種子上分離的病菌DNA，此方法比較繁瑣, 也降低了PCR的靈敏度[13]。本試驗(yàn)初期，曾使用試劑盒和CTAB 2種方法提取種子DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，使用CTAB法提取的種子DNA擴(kuò)增出的陽(yáng)性條帶數(shù)量低于使用試劑盒提取的種子DNA擴(kuò)增出的陽(yáng)性條帶數(shù)量，且結(jié)果重復(fù)性不穩(wěn)定，因此，選擇使用試劑盒來(lái)提取種子DNA。但種子中線蟲(chóng)DNA提取與檢測(cè)效率容易受到線蟲(chóng)蟲(chóng)口數(shù)量和種子中雜質(zhì)的影響，還需要對(duì)帶病種子中線蟲(chóng)DNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。

董立等[4]對(duì)64份涵蓋東北春谷區(qū)、西北春谷區(qū)和華北夏谷區(qū)的谷子品種進(jìn)行線蟲(chóng)病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)大部分品種為感病品種。本試驗(yàn)利用PCR方法檢測(cè)了99份谷子種子，33份種子檢測(cè)到攜帶谷子貝西滑刃線蟲(chóng)，該樣品主要來(lái)自春谷區(qū)，這與其研究結(jié)果是一致的；此外，董立等[4]研究中的晉谷21號(hào)是高感品種。在本研究中有來(lái)自4個(gè)不同地區(qū)的晉谷21號(hào)(C59、C60、C61、C62)，除了C61未檢測(cè)到貝西滑刃線蟲(chóng)外，其余3個(gè)地區(qū)的晉谷21檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；對(duì)于晉谷21號(hào)的2種檢測(cè)結(jié)果基本一致。

一些研究表明，谷子線蟲(chóng)病是夏谷區(qū)重要的病害[4,26-28]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)除來(lái)自海南的C85(66.7%)和C86(55.6%)2個(gè)品種檢測(cè)到貝西滑刃線蟲(chóng)外，在夏谷區(qū)(河北中南部和山東)并未檢測(cè)到貝西滑刃線蟲(chóng)的存在。分析原因可能是，夏谷區(qū)線蟲(chóng)病發(fā)生嚴(yán)重的谷穗會(huì)呈現(xiàn)紫色，肉眼容易分辨，在收獲時(shí)會(huì)舍棄病穗、留存健康穗的籽粒。這樣會(huì)導(dǎo)致本試驗(yàn)來(lái)自夏谷區(qū)的樣品大部分是健康籽粒，樣品不攜帶線蟲(chóng)或攜帶的線蟲(chóng)蟲(chóng)口數(shù)量極少，線蟲(chóng)DNA相對(duì)于種子DNA濃度太低未檢測(cè)到。今后要繼續(xù)對(duì)夏谷區(qū)主推谷子品種種子進(jìn)行線蟲(chóng)的檢測(cè)，以了解夏谷區(qū)線蟲(chóng)初侵染來(lái)源及發(fā)生規(guī)律。

本研究初步分析了33份陽(yáng)性樣本的遺傳多樣性，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出28S rRNA片段適合用于研究貝西滑刃線蟲(chóng)種群的遺傳多樣性。從研究結(jié)果可以看出，貝西滑刃線蟲(chóng)AB1出現(xiàn)頻率最高，是優(yōu)勢(shì)單倍型。其他單倍型僅出現(xiàn)過(guò)一次，屬于稀有單倍型。河北張家口和內(nèi)蒙古松山區(qū)分別具有7，4種單倍型，說(shuō)明兩地貝西滑刃線蟲(chóng)的遺傳多樣性最為豐富。

種傳病害是一類(lèi)以種子帶菌進(jìn)行傳播和擴(kuò)散的病害，號(hào)稱(chēng)作物的“癌癥”，均為系統(tǒng)性侵染病害。被侵染植株攜帶大量的病原菌，使種子帶病為其遠(yuǎn)距離傳播病害提供條件[4]。因此，種子帶線蟲(chóng)的檢測(cè)是防止該病害擴(kuò)散的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)采用的PCR檢測(cè)技術(shù)方法簡(jiǎn)單、快捷，只需要簡(jiǎn)單的PCR儀器即可完成；使用特異性引物GU-F/GU-R對(duì)貝西滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。該方法的推廣可以加快線蟲(chóng)檢測(cè)的進(jìn)度，為種子線蟲(chóng)檢測(cè)提供技術(shù)支持，有利于對(duì)谷子線蟲(chóng)病害的發(fā)生與傳播進(jìn)行防控，促進(jìn)谷子產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。