郭文博，哈 福，江明星，張自芳，錢林東，保志鵬，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院 畜牧獸醫(yī)學院，云南 昆明 650212)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是轉化生長因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)超家族成員，在脊椎動物胚胎干細胞分化和器官發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調控作用[1-2]。BMP作為TGF-β超家族中最大的配體亞家族，最早發(fā)現(xiàn)于1965年，迄今已經(jīng)識別和鑒定出的BMP成員不下20種[3]。BMP4基因是BMP基因家族中的重要成員，其編碼產(chǎn)物和其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白一樣，參與骨和軟骨組織的發(fā)育。已有研究顯示，BMP4在生殖細胞發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[4]。Li等[5]研究結果揭示BMP4通過參與BMP4/Smad信號通路在精原干細胞分化的調控過程中起重要作用。BMP4參與的信號轉導是由細胞內(nèi)信號轉導蛋白Smad介導的，BMP4通過與細胞表面2種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ型和Ⅱ型)結合形成異源復合物，Ⅱ型受體使Ⅰ型受體轉磷酸化，后者的激活導致Smad 1/5/8的磷酸化，然后導致Smad 1/5/8與Smad 4發(fā)生寡聚，并以復合物的形式轉移到細胞核并發(fā)揮轉錄因子的作用[6]。人類BMP4參與體內(nèi)復雜的調控過程，BMP4基因突變與人類眼球缺血性小眼病(Anophthalmia microphthalmia，AM)及SHORT綜合征等疾病的發(fā)生有關[7-8]。存在于哺乳動物體細胞和生殖細胞中的BMP4/Smad信號通路在精子生成和原始卵泡發(fā)育過程中的重要調控作用已得到證實[5,9-10]。

迄今，關于BMP4基因的研究多集中于人和小鼠上，該基因在其他動物上的研究報道較少。人類BMP4基因定位于染色體14q22.2-q23，編碼區(qū)全長1 227 bp，編碼408個氨基酸[7]。小鼠BMP4基因包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，其編碼區(qū)全長1 227 bp，編碼408個氨基酸[11]。有報道稱BMP4參與豬的卵泡發(fā)育過程[12]。從長白×大白雜交育肥豬的腎臟和脊髓中分離得到豬的BMP4編碼區(qū)序列，長度為1 230 bp，編碼409個氨基酸[13]。由NCBI數(shù)據(jù)庫上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，普通牛BMP4基因定位于10號染色體上，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，編碼區(qū)全長1 230 bp，編碼409個氨基酸。

水牛是我國南方極具開發(fā)潛力和價值的家畜，可以奶用、肉用和役用，但水牛繁殖效率低，發(fā)情周期長，發(fā)情癥狀不明顯，生殖細胞發(fā)育遲緩等在一定程度上限制了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，是目前水牛養(yǎng)殖過程中急需解決的問題。卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)生發(fā)育對水牛發(fā)情周期具有顯著影響。已有研究顯示，BMP4基因在哺乳動物卵巢生殖細胞成熟發(fā)育過程中起著重要的調節(jié)作用。因此，對BMP4基因的研究，有助于深入了解水牛卵巢發(fā)育和繁殖性狀的遺傳基礎。本研究對檳榔江水牛BMP4基因進行了分離及功能生物信息學和多個組織差異表達分析，以期揭示水牛BMP4基因的分子特征和生物學功能，為深入了解水牛BMP4在生殖細胞成熟過程中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

5頭雄性和5頭雌性的成年、健康的檳榔江水牛各采自云南騰沖市，它們相互之間無直接血緣關系。每頭牛屠宰后，分別迅速取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉、小腸、瘤胃、子宮、卵巢和睪丸組織，置于液氮中，帶回實驗室。

1.2 組織總RNA提取和cDNA合成

組織樣品總RNA提取采用RNAiso Plus(TaKaRa，中國大連)。通過核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性。cDNA第一鏈合成采用 Oligo(dT)18(500 μg/mL)和逆轉錄酶試劑盒(Invitrogen M-MLV，TaKaRa，中國大連)。將cDNA 母液稀釋成 50 ng/μL 的工作液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3 BMP4基因序列分離及多組織表達譜檢測

根據(jù)已公布的普通牛BMP4基因序列(NM_001045877)，采用Primer Premier 5.0軟件設計分別用于分離該基因完整編碼區(qū)及多組織差異表達分析的引物。以水牛18SrRNA基因序列(JN412502)設計內(nèi)參基因PCR引物。設計的引物送上海生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 PCR及半定量RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of PCR and Semi-quantitative RT-PCR

進行基因分離采用的PCR體系包含： 10×Buffer(Mg2+15 mmol/mL )4 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.7 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)2 μL， rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(TaKaRa，中國大連)，DNA模板2 μL(約100 ng)，ddH2O補至25 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s→退火30 s→72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

各組織差異表達分析采用半定量RT-PCR 方法進行檢測，反應體系包含： 10×Buffer(Mg2+15 mmol/mL )2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.5 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)2 μL， rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(TaKaRa，中國大連)，DNA模板2 μL(約100 ng)，ddH2O補至25 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s→退火30 s→72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用ORF finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorfi/orf.html)，對獲得的基因序列進行開放閱讀框預測，獲得編碼區(qū)全序列。將所獲得的CDS序列為查詢序列，應用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行基因同源性搜索，確定獲得序列的基因屬性。采用在線軟件Prosite、MART、Protparam、ProtScale、SignalP 4.0 server、TMHMM-2.0 server、 ProtComp、SOPA、SWISS-MODEL分別預測BMP4蛋白質功能位點、功能結構域、理化性質及氨基酸組成、疏水性、信號肽預測、跨膜結構域、亞細胞定位、二級、三級結構預測。利用EditPlus軟件進行序列編輯；利用Bioedit和DNAStar(DNAStar Inc.)軟件包進行序列拼接比對；利用MEGA 6進行物種間氨基酸序列比較、N-J系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及突變位點輸出。

采用Quantity One 軟件分析BMP4基因在各組織中的表達量。

2 結果與分析

2.1 水牛BMP4基因PCR分離

獲得目的擴增片段為1 476 bp，結果清晰無雜帶，見圖1。

M. DL2000分子量；1.水牛BMP4基因RT-PCR產(chǎn)物。M.Marker DL2000; 1.RT-PCR product of buffalo BMP4 gene.

2.2 BMP4 CDS區(qū)序列分析

獲得水牛BMP4基因的CDS序列為1 230 bp，編碼409個氨基酸(圖2)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源搜索比對，水牛序列與普通牛(NM_001045877)、野牦牛(XM_005901928)、綿羊(NM_001110277)、山羊(NM_001285646)的BMP4基因序列長度相同，序列同源性皆為99%，確定其為水牛BMP4基因序列(獲登錄號KF312880)。水牛BMP4基因CDS區(qū)A、G、T、C堿基的組成分別為22.68%，28.86%，19.51%，28.94%。在基因結構上，水牛BMP4基因與普通牛的相似，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子。

2.3 水牛BMP4分析

2.3.1 基本理化特征 檳榔江水牛與普通牛BMP4蛋白(NP_001039342)序列差異較小，基本理化特征相似，但普通牛BMP4蛋白穩(wěn)定性略高(表2)。

2.3.2 信號肽、細胞定位和跨膜結構域分析 檳榔江水牛BMP4蛋白具有1個信號肽序列(圖3-A)，該信號肽序列最大可能裂解位點在24-25位氨基酸。該蛋白不含跨膜結構域，最大疏水位點位于第14位半胱氨酸處(2.978)，最大親水位點位于第307位賴氨酸處(-3.300)，屬親水性蛋白(圖3-B)。亞細胞定位分析顯示，水牛BMP4蛋白屬胞外分泌型蛋白。

2.3.3 結構域與結構分析 在水牛BMP4蛋白上發(fā)現(xiàn)2個結構域，與普通牛保守結構域一致，在39-276位氨基酸處為TGFβ前導肽(TGFβ_propeptide)結構域，在309-409位氨基酸處為TGF-β超家族結構域，如圖4。在BMP4蛋白TGF-beta超家族結構域中，水牛與其他物種一致，均含有7個保守半胱氨酸殘基，半胱氨酸在不同物種蛋白序列上的位置見圖5。

陰影部分為保守結構域：39-276位氨基酸為TGF-beta前導肽結構域；309-409位氨基酸為TGF-beta超家族結構域；*.終止密碼子。The shaded part is a conserved domain: amino acids 39-276 belong to the TGF-beta propeptide domain;Amino acids 309-409 belong to the TGF-beta superfamily domain; *. Stop codon.

基本理化特征Basic physical and chemical properties水牛Buffalo普通牛Cattle氨基酸數(shù) Number of amino acids409409分子質量/ku Molecular weight 46.6446.64等電點/PI Isolectric point 8.578.57 分子式FormulaC2054H3225N619O596S16C2053H3223N619O596S16強酸性氨基酸殘基Strongly acidic amino acids (D,E)4646強堿性氨基酸殘基Strongly basic amino acids (K,R)5050疏水性氨基酸Hydrophobic amino aciads (A,I,L,F,W,V)128128極性氨基酸Polar amino acids (N,C,Q,S,T,Y)102102不穩(wěn)定系數(shù)Instability index59.4959.02脂肪系數(shù)Aliphatic index80.5480.54平均親水系數(shù)Grand average of hydropathicity (GRAVY)-0.543-0.543

SignalP-4.1 prediction(euk networks): Sequence.由SignalP-4.1程序預測(euk networks)的用戶氨基酸序列的信號肽；ProtScale output for user_sequence.由ProtScale程序輸出的用戶氨基酸序列的疏水性。

圖4 水牛BMP 4的保守結構域Fig.4 Putative conserved domain of buffalo BMP 4

- - - - - -.不同物種間完全相同的氨基酸序列；陰影部分為保守半胱氨酸殘基。- - - - - -.The same amino acid sequence between different species; The shaded part indicates the conserved Cysteine residue.

二級結構預測，水牛BMP4有24.45%的氨基酸構成α-螺旋(Alpha helices)，18.09%的氨基酸構成延伸鏈(Extended strands)，2.20%的氨基酸構成β-轉角(Beta turns)，55.26%的氨基酸構成無規(guī)則卷曲(Random coils)。進行蛋白質同源建模搜索顯示，水牛BMP4蛋白序列與Swiss-Model數(shù)據(jù)庫中的同源序列一致性小于30%，同源建?？尚哦容^低。

2.3.4 功能位點預測 水牛與普通牛BMP4蛋白(NP_001039342)功能位點完全一致，預測結果見表3。

表3 蛋白功能位點預測Tab.3 The prediction of protein functional sites

2.3.5 同源性分析 將水牛BMP4氨基酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源搜索，獲得下列物種的一致序列：牦牛(Bosmutus，XP_005901990)、普通牛(Bostaurus，NP_001039342)、綿羊(Ovisaries，NP_001103747)、山羊(Caprahircus，NP_001272575)、野豬(Susscrofa，NP_001094501)、犬(Canislupusfamiliaris，NP_001274099)、小鼠(Musmusculus，NP_031580)、狒狒(Papioanubis，NP_001162558)、人(Homosapiens，NP_001193)、馬(Equuscaballus，NP_001157442)。各物種BMP4蛋白氨基酸序列一致性比對結果見表4。水牛與牦牛的氨基酸序列完全一致，與其他?？莆锓N序列一致性超過99%，與非?？莆锓N間序列一致性超過97%。基于以上物種BMP4蛋白的氨基酸序列構建了NJ-系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示不同物種間BMP4蛋白的進化關系，結果表明，?？莆锓N聚在一起，且有較高的支持率(85%)(圖6)。

表4 不同物種間BMP4氨基酸序列一致性與分歧度Tab.4 Amino acid sequence consistency and divergence of BMP4 between different species %

注：對角線上方數(shù)值表示序列一致性，對角線下方數(shù)值表示序列分歧度。

Note: Data above the diagonal line represent the percent identify and below the diagonal line represent the sequential divergence.

圖6 水牛與其他物種BMP4氨基酸序列N-J系統(tǒng)樹Fig.6 N-J phylogenetic tree of BMP4 amino acid sequences in buffalo and other species

2.4 組織差異表達分析

采用半定量RT-PCR法，以18SrRNA作為內(nèi)參，檢測BMP4在檳榔江水牛11個組織中的差異表達。結果顯示(圖7)，BMP4基因只在水牛子宮、卵巢和睪丸中表達，其中在睪丸組織中表達水平最高。

18S rRNA表達作為內(nèi)參。M.DL2000 DNA Marker。1.子宮；2.卵巢；3.肝臟；4.瘤胃；5.小腸；6.肌肉；7.腎；8.肺；9.脾臟；10.睪丸；11.心臟。The expression level of 18S rRNA served as an internal control. M.DL2000 DNA Marker; 1. Testis; 2. Ovary; 3. Uterus; 4. Rumen; 5. Small intestine; 6. Muscle; 7. Kidney; 8. Lung; 9. Spleen; 10. Liver; 11. Heart.

3 討論

本研究分離獲得檳榔江水牛BMP4基因的編碼區(qū)序列長為1 230 bp，編碼409個氨基酸，與普通牛BMP4基因編碼區(qū)序列長度相同，序列一致性為99%。生物信息學分析顯示，檳榔江水牛BMP4蛋白含有一個信號肽，平均親水系數(shù)為-0.543，為親水性蛋白，不具有跨膜結構域，屬于胞外分泌型蛋白；水牛BMP4含有TGF-beta前導肽和TGF-beta超家族結構域。氨基酸序列比對結果顯示，水牛與野牦牛、普通牛、人、犬和小鼠等其他10個物種BMP4序列一致性在97%以上。物種間BMP4蛋白序列一致性較高，揭示了BMP4蛋白序列在進化上具有保守性。水牛與普通牛的BMP4基本理化特征、結構和功能位點極相似；在構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，水牛與野牦牛、普通牛、山羊和綿羊聚在一起，表明水牛與?？破渌锓N的BMP4在功能上更接近。

作為BMP/Smad信號通路的重要激活因子，BMP4在不同組織和器官內(nèi)廣泛存在并被特異性激活，進而調控細胞增殖、黏附、遷移、分化和凋亡等一系列細胞代謝過程，在胚胎發(fā)生和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程發(fā)揮著重要作用[5]。BMP4所含有的2個結構域中，TGF-β前導肽結構域又稱潛在相關肽(Latency associated peptide，LAP)，LAP與BMP4在體內(nèi)的組織特異性表達和傳導范圍有關，是產(chǎn)生具備穩(wěn)定功能活性的成熟BMP4蛋白所必需的調節(jié)肽[14]；TGF-β結構域存在7個保守的半胱氨酸，其中6個形成3個分子內(nèi)二硫鍵，稱為胱氨酸結，第7個半胱氨酸通過另一個單體結合形成共價二硫鍵，從而形成生物活性信號分子，并通過與Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸或蘇氨酸激酶受體結合來啟動信號傳遞[3]。人類BMP4基因的移碼突變(c.226del2，p.S76fs104X)發(fā)生于TGF-β前體結構域N-末端，個體表現(xiàn)出AM、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、近視、多指/并指和原發(fā)性腦發(fā)育障礙等癥狀[7]。大量研究表明，BMP系統(tǒng)在卵泡發(fā)生和排卵的過程中起著重要調節(jié)的作用，在原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和腔卵泡的卵母細胞中均有磷酸化Smad1/5的表達，表明BMP4/Smad信號通路促進原始卵泡發(fā)育啟動和原始卵泡存活[10]。免疫組化試驗表明，BMP4、BMP6、BMP7及其受體BMPRIB、BMPRII、ActRII和ActRIIB等在牛卵泡膜細胞中均有表達，這些受體可與BMP-4、BMP-6和BMP-7結合并形成功能性信號傳導復合物，從而激活Smad介導的細胞內(nèi)轉導途徑，調控卵泡膜細胞的增殖，肽類激素分泌等細胞反應[15]。免疫組化試驗證實，BMP4、BMP6、BMP7及其受體BMPR1和BMPR2在成年女性顆粒細胞內(nèi)表達[16]。BMP4是目前確認的唯一一個調控成人支持細胞發(fā)育和功能的自分泌因子，內(nèi)源性BMP4通過激活Smad1/5和ID2/3通路，促進成人支持細胞增殖及雄激素受體等精子生成必需蛋白的合成，其活性異常與人類非阻塞性無精癥有關[17]。本研究所得水牛BMP4序列也具有TGF-beta前導肽結構域和TGF-beta超家族結構域，與人類、普通牛等物種的BMP4保守結構域相同，功能位點種類一致，特別值得一提的是在BMP4蛋白TGF-beta超家族結構域中，水牛與其他物種都含有7個保守半胱氨酸殘基，其所構成的半胱氨酸結構基序是BMP4蛋白發(fā)揮功能的重要結構基礎。表明水牛BMP4蛋白與其他物種BMP4的功能相近，推測其可能參與水牛體內(nèi)BMP4/Smad信號通路的轉導，在水牛骨骼形成、卵泡發(fā)育和精子形成等過程中發(fā)揮重要調控功能。

BMP4在小鼠多種卵巢細胞類型中表達，在卵泡膜、黃體、卵巢表面上皮、性索和部分血管內(nèi)皮細胞中mRNA表達水平最高，在發(fā)育中的優(yōu)勢卵泡膜中mRNA表達水平較高，在閉鎖卵泡中mRNA表達水平非常低或不可檢測[18]。Fatehi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因mRNA在牛竇卵泡所有腔體中都有表達。實時熒光定量PCR結果顯示，BMP4在牛退化胚胎中的表達量較囊胚高，母體卵巢內(nèi)BMP4基因型與體外培養(yǎng)的囊胚率顯著相關，表明BMP4在胚胎和母體水平上對著床前胚胎發(fā)育起著重要的調節(jié)作用[20]。本研究顯示，BMP4基因在檳榔江水牛的卵巢、子宮組織中均有表達，揭示該基因在水牛這些組織中發(fā)揮功能，特別是在卵巢中可能參與了卵泡成熟過程。Hu等[21]發(fā)現(xiàn)，BMP4的mRNA主要表達于雄性小鼠精母細胞和支持細胞中，且在附睪發(fā)育過程中持續(xù)表達，在C57BL/6背景的BMP4雜合子雄性小鼠中出現(xiàn)生殖細胞退化、精子數(shù)量減少和精子活力下降等現(xiàn)象。RT-PCR顯示BMP4及其3種受體基因的轉錄本在新鮮分離的成人支持細胞和睪丸組織中表達。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4在水牛睪丸組織中表達且表達量最高，推測BMP4基因在水牛雄性生殖細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。鑒于BMP4基因在水牛生殖過程中的重要作用，進一步了解其具體的調控機制將有助于解析水牛繁殖性狀的形成機理，可為水牛繁殖性狀的選育提供依據(jù)。